Utilizzando biosensori a base di enzimi misurare Tonic e Phasic glutammato in modelli murini di Alzheimer
Summary
Qui, descriviamo l'installazione, software di navigazione, e l'analisi dei dati per un metodo spazialmente e temporalmente precisa misurazione toniche e fasiche cambiamenti glutammato extracellulare in vivo utilizzando matrici di microelettrodi enzimatico (MEA).
Abstract
interruzione Neurotrasmettitore è spesso una componente chiave di malattie del sistema nervoso centrale (SNC), giocando un ruolo nella patologia sottostante malattia di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la depressione e l'ansia. Tradizionalmente, microdialisi è stata la tecnica più comune (lodato) per esaminare i cambiamenti neurotrasmettitore che si verificano in questi disturbi. Ma poiché microdialisi ha la capacità di misurare lenti cambiamenti 1-20 minuti durante ampie aree di tessuto, ha lo svantaggio di invasività, potenzialmente distruggere collegamenti intrinseci all'interno del cervello e una capacità di campionamento lento. Una tecnica relativamente recente, l'array microelettrodo (MEA), presenta numerosi vantaggi per misurare le variazioni dei neurotrasmettitori specifici all'interno delle regioni cerebrali discrete che si verificano, rendendo per un approccio spazialmente e temporalmente preciso. Inoltre, utilizzando MEA è minimamente invasiva, consentendo la misurazione di alterazioni neurotrasmettitori in vivo. Nel nostro laboratorio, abbiamo hāve stato specificamente interessati a cambiamenti del neurotrasmettitore, il glutammato, legati alla patologia il morbo di Alzheimer. Come tale, il metodo qui descritto è stato utilizzato per valutare potenziali interruzioni dell'ippocampo in glutammato in un modello di topo transgenico della malattia di Alzheimer. In breve, il metodo utilizzato prevede il rivestimento di un microelettrodo multisito con un enzima molto selettivo per il neurotrasmettitore di interesse e utilizzando siti autoreferenziali di sottrarre il rumore di fondo e interferenti. Dopo la placcatura e la calibrazione, il MEA può essere costruito con una micropipetta e abbassato nel regione del cervello di interesse utilizzando un dispositivo stereotassico. Qui, il metodo descritto comporta anestetizzante RTG (tauP301L) 4510 topi e utilizzando un dispositivo stereotassico di indirizzare con precisione sub-regioni (DG, CA1 e CA3) dell'ippocampo.
Introduction
Misurare alterazioni neurotrasmettitore nel cervello è uno strumento essenziale per neuroscienziati studiano le malattie del sistema nervoso centrale (SNC) che sono spesso caratterizzati da disregolazione neurotrasmettitore. Sebbene microdialisi in combinazione con la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC / CE) è il metodo più diffuso per misurare le variazioni nei livelli di neurotrasmettitori extracellulari 1, 2, 3, 4, la risoluzione spaziale e temporale delle sonde da microdialisi può non essere ideale per neurotrasmettitori , come glutammato, che sono strettamente regolata nello spazio extracellulare 5, 6. A causa dei recenti progressi nel campo della genetica e di imaging, ci sono altri metodi che possono essere utilizzati per mappare glutammato in vivo. Utilizzando reporter glutammato fluorescenti geneticamente codificati (iGluSnFR) und immagini a due fotoni, i ricercatori sono in grado di visualizzare rilascio di glutammato da neuroni e astrociti in vitro ed in vivo 7, 8, 9. In particolare, questo permette di registrare da un campo visivo più ampio e non interrompe le connessioni intrinseche del cervello. Mentre queste nuove tecniche ottiche consentono la visualizzazione della cinetica glutammato e misurazione delle risposte evocate sensoriali e attività neuronale, non hanno la capacità di quantificare la quantità di glutammato nello spazio extracellulare in regioni cerebrali discrete.
Un metodo alternativo è la matrice microelettrodi enzimatico (MEA) che può selettivamente misurare i livelli di neurotrasmettitori extracellulari, quali glutammato, attraverso l'uso di un sistema di registrazione di auto-riferimento. La tecnica MEA è stato utilizzato per studiare le alterazioni di glutammato extracellulare seguenti cerebrali traumatichelesioni 10, 11, 12, invecchiamento 13, 14, stress 15, 16, epilessia 17, 18, morbo di Alzheimer 19, 20, e l'iniezione di un virale mimico 21 e rappresenta un miglioramento rispetto dei limiti spaziali e temporali inerenti microdialisi. Considerando microdialisi limita la capacità di misurare vicino alla sinapsi 22, 23, MEA hanno una risoluzione spaziale elevata che consente misure selettive di straripamento extracellulare glutammato vicino sinapsi 24, 25. In secondo luogo, la bassa risoluzione temporale di microdialisi (1 – 20 min) limita la capacità di indagare ladinamica veloce di rilascio di glutammato e la clearance si verificano nel millisecondo secondo intervallo 26. Perché le differenze nel rilascio o la clearance di glutammato non possono essere evidenti nelle misure di tonico, riposo livelli di glutammato, può essere necessario che il rilascio di glutammato e la clearance essere misurati direttamente. MEA tengono conto di tali misure a causa della loro elevata risoluzione temporale (2 Hz) e limiti di rilevabilità (<1 um). Terzo, MEA consentire l'analisi di variazioni subregionali neurotrasmettitori all'interno di una particolare regione del cervello, come l'ippocampo di ratto o topo. Ad esempio, utilizzando MEA possiamo separatamente bersaglio il giro dentato (DG), comu Ammonis 3 (CA3) e comu Ammonis 1 (CA1) dell'ippocampo, che sono collegati tramite un circuito trisynaptic 27, di esaminare le differenze subregionali glutammato extracellulare. A causa delle dimensioni di sonde microdialisi (1 – lunghezza 4 mm) e il danno causato per impiantazione 28 </ sup>, 29, le differenze subregionali sono difficili da affrontare. Inoltre, i sistemi ottici consentono solo la stimolazione tramite stimoli esterni, come ad esempio una stimolazione baffo o sfarfallio luce, che non consente la stimolazione subregionale 7. Un vantaggio finale di MEA rispetto ad altri metodi è la possibilità di studiare queste subregioni in vivo senza interrompere le loro connessioni estrinseche e intrinseche.
Qui, viene descritto come un sistema di registrazione (per esempio, FAST16mkIII) in combinazione con MEA, costituito da un microelettrodo multisito a base di ceramica, può essere differenzialmente rivestito sui siti di registrazione per consentire agli agenti interferenti essere rilevato e rimosso dal segnale analita. Dimostriamo anche queste matrici possono essere utilizzati per studi Amperometry-di regolazione in vivo glutammato all'interno della DG, CA3 e CA1 ippocampali subregioni di anestetizzato RTG (tauP301L) 4510 topi, un m comunemente usatoil modello Ouse della malattia di Alzheimer. Inoltre, forniamo conferma della sensibilità del sistema MEA alla dinamica veloci di rilascio di glutammato e di passaggio trattando i topi con riluzolo, un farmaco mostrato in vitro per diminuire il rilascio di glutammato e aumentare glutammato captazione 30, 31, 32, 33, e dimostrando queste rispettive variazioni in vivo nel modello murino tauP301L.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica MEA consente la misurazione della rapida cinetica di rilascio di neurotrasmettitore e l'assorbimento in vitro e in vivo. Quindi, la tecnologia produce una vasta gamma di uscita dati compresi livelli di neurotrasmettitore tonico, rilascio di neurotrasmettitore evocato, e la clearance neurotrasmettitore. Tuttavia, perché l'uso di MEA è una procedura relativamente complessa, ci sono numerosi fattori che possono avere bisogno di essere ottimizzato per l'uso con successo. Ad esempio…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of scienze mediche generali (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), Associazione Alzheimer (MNR; NIRG-12-242.187), WVU facoltà di ricerca Senato Grant (MNR), e WVU PSCOR di Grant (MNR).
Materials
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #701 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | 782000 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
Riferimenti
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