Qui, descriviamo l'installazione, software di navigazione, e l'analisi dei dati per un metodo spazialmente e temporalmente precisa misurazione toniche e fasiche cambiamenti glutammato extracellulare in vivo utilizzando matrici di microelettrodi enzimatico (MEA).
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Articolo metodologico
Utilizzando biosensori a base di enzimi misurare Tonic e Phasic glutammato in modelli murini di Alzheimer
In questo articolo
Sommario
Abstract
interruzione Neurotrasmettitore è spesso una componente chiave di malattie del sistema nervoso centrale (SNC), giocando un ruolo nella patologia sottostante malattia di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la depressione e l'ansia. Tradizionalmente, microdialisi è stata la tecnica più comune (lodato) per esaminare i cambiamenti neurotrasmettitore che si verificano in questi disturbi. Ma poiché microdialisi ha la capacità di misurare lenti cambiamenti 1-20 minuti durante ampie aree di tessuto, ha lo svantaggio di invasività, potenzialmente distruggere collegamenti intrinseci all'interno del cervello e una capacità di campionamento lento. Una tecnica relativamente recente, l'array microelettrodo (MEA), presenta numerosi vantaggi per misurare le variazioni dei neurotrasmettitori specifici all'interno delle regioni cerebrali discrete che si verificano, rendendo per un approccio spazialmente e temporalmente preciso. Inoltre, utilizzando MEA è minimamente invasiva, consentendo la misurazione di alterazioni neurotrasmettitori in vivo. Nel nostro laboratorio, abbiamo hāve stato specificamente interessati a cambiamenti del neurotrasmettitore, il glutammato, legati alla patologia il morbo di Alzheimer. Come tale, il metodo qui descritto è stato utilizzato per valutare potenziali interruzioni dell'ippocampo in glutammato in un modello di topo transgenico della malattia di Alzheimer. In breve, il metodo utilizzato prevede il rivestimento di un microelettrodo multisito con un enzima molto selettivo per il neurotrasmettitore di interesse e utilizzando siti autoreferenziali di sottrarre il rumore di fondo e interferenti. Dopo la placcatura e la calibrazione, il MEA può essere costruito con una micropipetta e abbassato nel regione del cervello di interesse utilizzando un dispositivo stereotassico. Qui, il metodo descritto comporta anestetizzante RTG (tauP301L) 4510 topi e utilizzando un dispositivo stereotassico di indirizzare con precisione sub-regioni (DG, CA1 e CA3) dell'ippocampo.
Introduzione
Misurare alterazioni neurotrasmettitore nel cervello è uno strumento essenziale per neuroscienziati studiano le malattie del sistema nervoso centrale (SNC) che sono spesso caratterizzati da disregolazione neurotrasmettitore. Sebbene microdialisi in combinazione con la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC / CE) è il metodo più diffuso per misurare le variazioni nei livelli di neurotrasmettitori extracellulari 1, 2, 3, 4, la risoluzione spaziale e temporale delle sonde da microdialisi può non essere ideale per neurotrasmettitori , co....
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Protocollo
1. Rivestimento l'Array microelettrodo con enzimi o strato di matrice
- Preparazione della soluzione matrice proteica
- Pesare 10 mg di albumina sierica bovina (BSA) e trasferire alla provetta da microcentrifuga da 1,5.
- Aggiungere 985 ml di acqua distillata alla provetta contenente BSA. Mescolare la soluzione dal manuale di agitazione (ri-pipettaggio utilizzando 1.000 microlitri pipetta ~ 3 volte, fino a quando la BSA è sciolto).
NOTA: non utilizzare vortex per miscelare la soluzione in quanto ciò può introdurre aria nella soluzione. Inoltre, impostare la pipetta ad un volume <1.000 ml (ad esempio 700 ml)....
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Risultati
Anche se questa tecnologia può essere utilizzata per misurare alterazioni glutamatergici segnalazione in molti tipi di modelli animali, come ad esempio lesioni traumatiche del cervello, l'invecchiamento, lo stress e l'epilessia, qui si dimostra come la tecnologia MEA può essere utilizzato per esaminare le alterazioni glutamatergici a modello di topo transgenico di taupatia umano 19, 20. La RTG (tauP301L) 4510 del mouse es.......
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Discussione
La tecnica MEA consente la misurazione della rapida cinetica di rilascio di neurotrasmettitore e l'assorbimento in vitro e in vivo. Quindi, la tecnologia produce una vasta gamma di uscita dati compresi livelli di neurotrasmettitore tonico, rilascio di neurotrasmettitore evocato, e la clearance neurotrasmettitore. Tuttavia, perché l'uso di MEA è una procedura relativamente complessa, ci sono numerosi fattori che possono avere bisogno di essere ottimizzato per l'uso con successo. Ad esempio, .......
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Dichiarazioni
GG è l'unico proprietario di Quanteon, LLC che rende il sistema di registrazione-16 VELOCE utilizzato per le misurazioni del glutammato in questo studio. JEQ è un consulente pagato per Quanteon.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of scienze mediche generali (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), Associazione Alzheimer (MNR; NIRG-12-242.187), WVU facoltà di ricerca Senato Grant (MNR), e WVU PSCOR di Grant (MNR).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| FAST-16mkIII-8 canali | Quanteon | 16mkIII | |
| CenMet | W4 o 8-TRK | ||
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (scade dopo 1 mese) |
| Glutaraldeide | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (scade dopo 6 mesi) |
| Glutammato ossidasi | US Biological o Sigma Aldrich | G4001-01 o 100646 | 50 UI (scade dopo 6 mesi) |
| Hamilton Siringhe | Hamilton | #80383 | 2 siringhe |
| Metanolo | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Fenilendiammina dicloridrato (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Elettrodi di riferimento (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 elettrodi |
| Alimentato a batteria Magnetico piastra di agitazione | Cole-parmer | EW-04804-01 | Può acquistare da diversi fornitori |
| Glutammato | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Acido ascorbico | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamina cloridrato | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Acido perclorico | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Cloruro di postassio | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Cloruro di sodio | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Cloruro di calcio | MP | 153502 | 100 g |
| Idrossido di sodio | BDH | 1310732 | 500 g |
| Pipette di espulsione a pressione in vetro | Cera | ||
| Kerrlab | 625 | Può acquistare da un fornitore diverso | |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Argilla da modellare | WalMart | Può acquistare da diversi fornitori | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Filo d'argento | AM systems | #786500 | |
| Acido cloridrico | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Filo di platino | AM Systems | 778000 | |
| Pistola per saldatura | Lowes o Home Depot | Può acquistare da un fornitore diverso | |
| Multimetro | WalMart | Può acquistare da un fornitore diverso | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Può acquistare da un fornitore diverso | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Può acquistare da un fornitore diverso | |
| Dispositivo | stereotassicoStoelting | Può acquistare da un fornitore diverso | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Può acquistare da un fornitore diverso | |
| Microscopio Meiji EMZ | Meiji | EMZ-5 | |
| Trapano | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Bisturi | VWR | Può acquistare da un fornitore diverso | |
| Forbici chirurgiche | VWR | Può acquistare da un fornitore diverso | |
| Tamponi di cotone sterili | Puritan | 25806 | Può acquistare da un fornitore diverso |
| Unguento per gli occhi Unguento | veterinario Puralube Ottenere | dal veterinario | |
| Tamponi di iodio | VWR | S48050 | Può acquistare da un fornitore diverso |
| Tamponi alcolici | Farmacia locale | Può acquistare da un fornitore diverso | |
| Telo chirurgico sterile | Dynarex | 4410 | Può acquistare da un fornitore diverso |
| Soluzione salina sterile | Teknova | S5815 | Può fare la propria soltuion utilizzando i filtri |
| Perossido di idrogeno (3%) | Farmacia | Può acquistare da un fornitore diverso | |
| Pad riscaldante | WalMart | Può acquistare da diversi fornitore |
Riferimenti
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Cavus, I., et al.
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Ristampe e permessi
