Burada, tonik ve enzim-bağlı mikroelektrot dizileri (MEA) kullanılarak in vivo olarak fazik hücre dışı glutamat değişiklikleri ölçmek için bir uzamsal ve zamansal hassas bir yöntem için kurulum, yazılım navigasyon ve veri analizi tarif eder.
Nörotransmitter aksama Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, depresyon ve anksiyete altında yatan patolojide rol oynayan, genellikle merkezi sinir sisteminde (MSS) hastalıklarının önemli bir bileşenidir. Geleneksel olarak, mikrodiyaliz bu hastalıklarda meydana nörotransmitter değişiklikleri incelemek için en yaygın (övülen) tekniği olmuştur. Mikrodiyaliz doku büyük alanlar boyunca yavaş 1-20 dakika değişiklikleri ölçmek yeteneğine sahiptir çünkü, bu potansiyel olarak beyin ve yavaş numune alma kabiliyeti olan içsel bağlantıları yok, invaziflik dezavantajına sahiptir. Nispeten yeni bir teknik, mikroelektrot dizi (MEA) meydana olarak bir uzamsal ve zamansal hassas bir yaklaşım için yapım ayrık beyin bölgelerinde spesifik nörotransmitter değişimleri ölçmek için birçok avantajı vardır. Buna ek olarak, ÇÇA kullanılarak in vivo nörotransmiter değişiklikleri ölçme imkanı veren, minimal invaziv. Laboratuvarımızda, biz haAlzheimer hastalığı patolojisi ile ilişkili nörotransmiter, glutamat, değişimlere özel olarak ilgi geçtim. Bu nedenle, burada tarif edilen yöntem, Alzheimer hastalığının bir transgenik fare modelinde glutamat potansiyel hipokampal aksaklıkları değerlendirmek için kullanılmıştır. Kısaca, yöntem, ilgilenilen ve arka plan gürültüsünü ve girişimcileri dışarı çıkarmak için kendinden referanslı siteleri kullanma nörotransmiter için çok seçici bir enzim ile bir çok site mikroelektrot kaplanır; kullanılır. kaplama ve kalibrasyon sonra MEA mikropipet ile tasarlanmış olabilir ve bir stereotaksik aracı kullanılarak ilgili beyin bölgesi içine indirilir. Burada yöntem, RTG (TauP301L) 4510 fareler anestezi ve hassas hipokampusun alt bölgeler (DG, CA1, ve CA3) hedef bir stereotaksik cihaz kullanılarak içerir tarif.
beyinde nörotransmitter değişiklikleri ölçme genellikle nörotransmitter düzensizliği ile karakterize edilen merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıklarının araştırılmasında sinirbilimciler için önemli bir araçtır. Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC / EC) ile kombinasyon halinde hücre dışı mikrodiyaliz nörotransmitter seviyeleri 1, 2, değişiklikleri ölçmek için en yaygın olarak kullanılan yöntem olmuştur rağmen, 3, 4, mikrodiyaliz probları uzamsal ve zamansal çözünürlüğü nörotransmiter için ideal olmayabilir , bu şekilde sıkıca hücre dışı alan 5, 6 düzenlenmiştir glutamat gibi. Çünkü genetik ve görüntülemede son gelişmeler, in vivo olarak glutamat eşleştirmek için kullanılabilecek ek yöntem vardır. genetik olarak kodlanmış glutamat floresan haberci kullanılarak (iGluSnFR) bird, çift foton görüntüleme, araştırmacılar, in vitro ve di vivo 7, 8, 9 hem de nöron ve astrositler tarafından glutamat salınmasını görselleştirmek mümkün bulunmaktadır. Özellikle, bu daha geniş bir görüş alanına kayıt için izin verir ve beynin içsel bağlantılarını kesintiye uğratmaz. Bu yeni optik teknikler glutamat kinetik ve duyusal uyarılmış cevaplar ve nöronal aktivitenin ölçümü görselleştirilmesi için imkan vermesine rağmen, farklı beyin bölgelerinde hücre dışı boşlukta glutamat miktarını belirlemek için kabiliyetinden yoksundur.
Alternatif bir yöntem, selektif olarak kendinden başvurulan kayıt düzeni kullanmak suretiyle, glutamat gibi hücre dışı taşıyıcıların seviyelerini ölçebilir, enzime bağlı mikroelektrot dizi (MEA) 'dir. MEA tekniği travmatik beynin aşağıdaki hücre dışı glutamat değişiklikleri incelemek için kullanılmıştıryaşlanma yaralanma 10, 11, 12, 13, 14, stres 15, 16, epilepsi 17, 18, Alzheimer hastalığı 19, 20, ve bir viral mimik 21 enjeksiyonu mikrodiyaliz doğasında uzamsal ve zamansal sınırların üzerinde bir gelişmeyi temsil etmektedir. Mikrodiyaliz sinaps 22, 23 yakınında ölçmek için sınırlayan ise, taraflı çevre hücre dışı glutamat yayılma seçici önlemler yakınındaki 24, 25 sinapsların izin veren yüksek uzamsal çözünürlüğü vardır. İkinci olarak, mikrodiyaliz düşük zamansal çözünürlüğü (1-20 dakika) araştırmak için sınırlarİkinci aralıkta 26 milisaniye meydana gelen glutamat salınımı ve açıklık hızlı dinamikleri. glutamat veya arıtılması farklılıklar glutamat düzeylerini dinlenme tonik ölçümünde de, belirgin olmayabilir, çünkü glutamat salma ve temizlik doğrudan ölçülen edilmesi gerekli olabilir. Taraflı çevre nedeniyle yüksek zamansal çözünürlüğü (2Hz) ve algılama düşük olan bu sınırların (<1 uM) bu tür önlemler için izin verir. Üçüncü olarak, taraflı çevre örneğin sıçan veya fare hipokampta gibi belirli bir beyin bölgesi içinde nörotransmitterlerin alt-varyasyonlar, incelemesine olanak sağlar. Örneğin hücre dışı glutamat alt-farklılıklarını incelemek için, ayrı ayrı dentat girus (DG), bir trisynaptic devresi 27 ile bağlanır, hipokampus, ve cornu ammonis 3 (CA3) ve cornu ammonis 1 (CA1) hedefleyebilir ÇÇA kullanılmıştır. Implantasyon 28 <neden olduğu – (4 mm uzunluğu 1) ve hasar nedeniyle mikrodiyaliz probları büyüklüğü/ sup>, 29 alt-farklar ele almak zordur. Ayrıca, optik sistemler sadece bu alt-stimülasyon 7 izin vermeyen bir bıyık uyarılması veya hafif titreme gibi dış uyarıcılara yoluyla ulaşmayı sağlamaktadır. Diğer yöntemlere göre ÇÇA son bir yararı onların dışsal ve içsel bağlantıları aksatmadan in vivo bu alt bölgeleri incelemek için yeteneğidir.
Burada, bir seramik bazlı çoklu mikroelektrot içeren ÇÇA ile kombinasyon halinde bir kayıt sistemi (örneğin, FAST16mkIII), diferansiyel tayinle ve analit sinyali kaldırılacak maddeleri müdahale sağlamak için kayıt sitelerinde kaplanabilir açıklar. Ayrıca bu diziler amperometri tabanlı DG, CA3 içindeki in vivo glutamat düzenleme çalışmaları ve anestezi uygulanmış RTG CA1 hipokampal alt bölgelerde kullanılabilir göstermektedir (TauP301L) 4510 fareler, yaygın olarak kullanılan bir m,Alzheimer hastalığının ouse modeli. Buna ek olarak, riluzol farelere işlenmesiyle glutamat salınması ve klirens hızlı dinamiklerine MEA duyarlılığın onayı verir, in vitro olarak gösterilen bir ilaç glutamat salınmasını azaltmak ve glutamat alımını 30, 31, 32, 33 arttırılması için ve TauP301L fare modelinde di vivo bu ilgili değişiklikleri gösteren.
MEA tekniği, in vitro ve in vivo olarak nörotransmitter salımının ve alımının hızlı kinetik ölçümü sağlar. Bu nedenle, teknik tonik nörotransmitter düzeyleri de dahil olmak üzere veri çıkışı, uyarılmış nörotransmiter salımı ve sinir ileticisi temizlenmesinin bir çok çeşitli üretir. ÇÇA kullanımı nispeten karmaşık bir işlemdir Ancak, başarılı kullanım için optimize edilmesi gerekebilir sayısız faktörler vardır. Örneğin, kalibrasyon sırasında,…
The authors have nothing to disclose.
(; U54GM104942 mnr), NIA (mnr; R15AG045812), Alzheimer Derneği (MNR'nin; NIRG-12-242187), SUV Fakültesi Araştırma Senato Grant (mnr) ve SUV PSCOR Grant Bu çalışma, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklendi (MNR).
FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
Hamilton Syringes | Hamilton | #701 | 2 syringes |
Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
Picospritzer III | Parker | ||
Silver wire | AM systems | 782000 | |
Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
Drill | Dremel | Micro | |
Metricide | Metrex | 102800 | |
Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |