Qui, presentiamo un protocollo per fibra muscolare rapida analisi, che permette di aumentare la qualità della colorazione, e quindi l'acquisizione automatica e la quantificazione delle popolazioni fibre utilizzando il software ImageJ liberamente disponibile.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un rapido protocollo automatizzato per Fibra muscolare Analisi Popolazione nel ratto muscolari sezioni trasversali utilizzando una catena pesante della miosina immunoistochimica
In questo articolo
Sommario
Abstract
La quantificazione delle popolazioni di fibra muscolare fornisce una più profonda comprensione degli effetti di malattie, traumi, e varie altre influenze sulla composizione del muscolo scheletrico. Vari metodi in termini di tempo sono stati tradizionalmente usati per studiare le popolazioni di fibra in molti campi della ricerca. Tuttavia, recentemente sviluppato metodi immunoistochimici basati su proteine espressione della catena pesante della miosina fornire una rapida alternativa per identificare i tipi di fibre multiple in una singola sezione. Qui, vi presentiamo un protocollo rapido, affidabile e riproducibile per migliorare la qualità della colorazione, consentendo l'acquisizione automatica di profilati trasversali interi e quantificazione automatica delle popolazioni fibra con ImageJ. A questo scopo, i muscoli scheletrici incorporati sono tagliati in sezioni, colorati con miosina catene pesanti anticorpi con anticorpi fluorescenti secondarie e DAPI per nuclei delle cellule colorazione. intere sezioni trasversali vengono esaminati automaticamente utilizzando uno scanner diapositiva per ottenere alta risoluzione compositole fotografie dell'intera campione. analisi demografiche fibra vengono successivamente eseguite per quantificare fibre lente, intermedie e rapide utilizzando una macro automatizzato per ImageJ. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo metodo può identificare popolazioni di fibre in modo affidabile ad un grado di ± 4%. Inoltre, questo metodo riduce la variabilità inter-utente e tempo per analisi significativamente utilizzando la piattaforma open source ImageJ.
Introduzione
Composizione muscolo scheletrico subisce profonde modificazioni durante i processi fisiologici quali l'invecchiamento 1, 2, 3 esercizio, 4, 5, 6, 7, o processi patofisiologici come il morbo 8, 9, 10 o 11 trauma. Quindi, diversi campi di concentrato di ricerca sugli effetti strutturali di questi processi per capire i cambiamenti ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure tra soggetti animali sono state condotte nel rispetto dei principi di cura degli animali da laboratorio, come raccomandato dal FELASA 26. Soddisfazione è stata ottenuta prima dello studio da parte del comitato di revisione istituzionale della Medical University di Vienna e dal Ministero austriaco per la ricerca e la scienza (BMWF: Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung, numero di riferimento: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3b / 2014).
1. muscolare Harvest
NOTA: una precedente pubblicazione da Meng et al. 27 è disponibile che descrive il corretto con....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Intero ratto muscolari sezioni sono state colorate rapidamente utilizzando l'immunoistochimica per identificare MHC I, IIA e IIB fibre muscolari. Utilizzando uno scanner vetrino da microscopio a fluorescenza, intere sezioni sono state poi acquisiti automaticamente per fibra muscolare automatizzata analisi con ImageJ. Il concetto del procedimento si basa sulla fornitura di un flusso di lavoro semplice, affidabile e in tempi rapidi per la quantificazione delle fibre muscolari.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Qui, dimostriamo una metodologia ampiamente accessibile per studiare e quantificare le popolazioni di fibre muscolari di sezioni trasversali di ratto mediante immunoistochimica in modo efficiente tempo automaticamente. Per la riproducibilità, presentiamo un passo dettagliate descrizione passo e potenziali modifiche per applicazioni in altre specie non descritte in questo studio. Inoltre, si discute i vantaggi del procedimento, prerequisiti per la funzione ottimale e suoi limiti.
Attual.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione Christian Doppler Research. Vorremmo ringraziare Sabine Rauscher dal Nucleo strumento Imaging presso l'Università di Medicina di Vienna, Austria per il supporto durante tutto il progetto. Gli anticorpi primari sono stati sviluppati da Schiaffino, S., ottenuto dal Developmental Studies Ibridoma Bank, creata dal NICHD del NIH e mantenuta a L'University of Iowa, Dipartimento di Biologia, Iowa City, IA.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Composto O.C.T | Tissue-Tek, Sakura, Paesi Bassi | Per l'inclusione del tessuto muscolare | |
| Isopentano | per un adeguato congelamento del tessuto muscolare | ||
| Vetrini Superfrost Ultra Plus | Thermo Scientific, Germania | 1014356190 | vetrini adesivi |
| salina tamponata con fosfato | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germania | 85112 | solutivo |
| Thermo Scientific, Germania | 50197Z | Siero di capra | |
| DAKO Mezzo di montaggio fluorescente | Dako Danimarca | S3023 | |
| Penna Dako | Danimarca | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Anticorpi primari | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi (DSHB, Iowa, USA) | Surnatante | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi (DSHB, Iowa, USA) | Surnatante | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatante | |
| Anticorpi secondari | |||
| Alexa Fluor 633 Capra Anti-Topo IgG2b | Thermo Scientific, Germania | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Capra Anti-Topo IgG1 ( γ 1) | Thermo Scientific, Germania | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 IgM (µ catena) anti-topo di capra) | Thermo Scientific, Germania | A-21426 | |
| Reagente NucBlue Fixed Cell ReadyProbes | Thermo Scientific, Germania | R37606 |
Riferimenti
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
