Evaluación de la Viabilidad Neuronal Utilizando Colorante de Fluoresceína-Ioduro de Propidio Doble Coloración en Gránulos Cerebelosos Cultura de Neuronas
Summary
Este protocolo describe cómo medir con precisión la viabilidad neuronal utilizando fluoresceína diacetato (FDA) y Propidium Iodide (PI) doble tinción en neuronas cultivadas de gránulos cerebelosos, un cultivo neuronal primario utilizado como un modelo in vitro en neurociencia y neurofarmacología investigación.
Abstract
Las neuronas de gránulos cerebelosos cultivadas primarias (CGN) han sido ampliamente utilizadas como un modelo in vitro en neurociencia y neurofarmacología. Sin embargo, la coexistencia de células gliales y neuronas en el cultivo CGN podría conducir a sesgos en la evaluación precisa de la viabilidad neuronal. El diacetato de fluoresceína (FDA) y la tinción doble de yoduro de propidio (PI) se han utilizado para medir la viabilidad celular mediante la evaluación simultánea de las células viables y muertas. Se utilizó FDA-PI doble tinción para mejorar la sensibilidad de los ensayos colorimétricos y para evaluar la viabilidad neuronal en CGNs. Además, se añadieron manchas azules fluorescentes de ADN ( por ejemplo, Hoechst) para mejorar la precisión. Este protocolo describe cómo mejorar la precisión de la evaluación de la viabilidad neuronal mediante el uso de estos métodos en CGN cultivo. Usando este protocolo, el número de células gliales puede ser excluido usando microscopía de fluorescencia. Una estrategia similar se puede aplicar para distinguir el gli no deseadoAl de células de neuronas en diversos cultivos celulares mixtos, tales como cultivo cortical primario y cultivo del hipocampo.
Introduction
Los ensayos de citotoxicidad colorimétrica, tales como el ensayo de bromuro de 3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difenil-2-H-tetrazolio (MTT), se usan comúnmente para medir la viabilidad celular in vitro . Las neuronas de gránulos cerebelosos (CGN) de ratas primarias cultivadas son sensibles a diversas neurotoxinas, incluyendo el ion 1-metil-4-fenilpiridinio, el peróxido de hidrógeno y el glutamato 1 , 2 . Por lo tanto, los cultivos CGN pueden ser utilizados como un modelo in vitro en el campo de la neurociencia. Los cultivos CGN pueden contener una variedad de células, incluyendo neuronas y células gliales, que pueden representar alrededor del 1% del total de células en el cultivo CGN. Sin embargo, las células gliales responden de manera diferente a las neurotoxinas en comparación con las neuronas, lo que lleva a un sesgo en la viabilidad neuronal medido por ensayos colorimétricos [ 3] .
En las células viables, el diacetato de fluoresceína (FDA) puede convertirse en fluoresceína por esterasa.El yoduro de propidio (PI) puede interactuar con el ADN después de penetrar en células muertas y puede usarse para indicar la apoptosis dentro del cultivo. Por lo tanto, la tinción doble FDA-PI puede evaluar simultáneamente células viables y células muertas, lo que sugiere que la viabilidad celular puede medirse con mayor precisión combinando ambos métodos colorimétricos. Además, añadiendo Hoechst, una mancha fluorescente azul para los núcleos, la exactitud de la viabilidad celular podría ser mejorada. El protocolo presentado aquí describe tinción doble FDA-PI y tinción triple FDA-PI-Hoechst, que puede usarse para analizar con precisión la viabilidad neuronal en CGNs cultivados primarios.
Este protocolo aprovecha la visualización y la distinción de CGNs y células gliales por sus diferentes tamaños y formas. Después de la tinción, el número de neuronas viables y neuronas muertas se cuentan a partir de imágenes representativas tomadas por microscopía fluorescente. Las células gliales de gran tamaño se excluyen mediante la comparación de CGN típicos tAken en modo fluorescente con las tomadas en modo de contraste de fase. Se puede llevar a cabo una estrategia similar para medir la viabilidad neuronal en cultivos de células mixtas que contienen neuronas y células gliales, tales como cultivos corticales primarios y cultivos de hipocampo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo se modificó a partir de procedimientos que se han descrito previamente [ 6 , 7] . Los investigadores han dedicado tiempo tratando de reducir el crecimiento de células no neuronales mediante la mejora de las condiciones de cultivo de neuronas primarias in vitro [ 8] . Sin embargo, incluso con mejores condiciones de cultivo, algunas células gliales permanecen. Además, las células no neuronales son necesarias en …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las concesiones de la fundación de la ciencia natural de la provincia de Zhejiang (LY15H310007), el proyecto de investigación aplicado en la tecnología sin fines de lucro de la provincia de Zhejiang (2016C37110), la fundación nacional de la ciencia natural de China (U1503223, 81673407) (2014D10019), el Equipo de Innovación Municipal de Ningbo de Ciencias de la Vida y la Salud (2015C110026), el Provincial de Guangdong Proyecto de Cooperación Internacional de Ciencia y Tecnología (No. 2013B051000038), Shenzhen Programa de Investigación Básica (JCYJ20160331141459373), el Guangdong Hong (GHP / 012 / 16GD), el Consejo de Becas de Investigación de Hong Kong (15101014), la Universidad Politécnica de Hong Kong (G-YBGQ) y el Fondo KC Wong Magna de la Universidad de Ningbo.
Materials
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Cytosine β-D-Arabinofuranoside | Sigma | C1768 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | high quality FBS is essential for culture |
| 100× glutamine | Gibco | 25030081 | |
| 100× anti-biotic | Gibco | 15240062 | |
| BME medium | Gibco | 21010046 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma | F7378 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| Hoechst 33342 | Yesen | 40731ES10 | |
| rabbit Anti-GAP43 antibody | Abcam | ab75810 | |
| mouse Anti-GFAP antibody | Cellsignaling | 3670 | |
| Bovine serum albumin | Sangon Biotech | A602440 | |
| Trypsin | Sigma | T4665 | |
| DNAse | Sigma | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pasteur pipette | Volac | Z310727 | burn the tip round before use |
| 12-well cell culture plates | TPP | Z707783 | |
| 6-well cell culture plates | TPP | Z707759 | high quality cell culture plate is essential for culture |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Pipet 5 ml | Excell Bio | CS017-0003 | |
| Pipet 10 ml | Excell Bio | CS017-0004 | |
| Dissect microscope | Shanghai Caikang | XTL2400 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 311 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | TI-S | |
| Fluorescence filter and emmision cubes | Nikon | B-2A, G-2A, UV-2A | |
| Photo software | Nikon | NIS-Elements | |
| Graphics editor softeware | Adobe | Photoshop CS | |
| Image process softeware | NIH | ImageJ |
Riferimenti
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