肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離
Summary
このプロトコルにより、研究者を分離し、特徴付ける組織居住者様々 なマクロファージ ホールマーク食事誘発代謝疾患モデルから抽出された組織の炎症。
Abstract
肥満は、主として単球由来マクロファージと同様に、住民組織マクロファージによる慢性的な炎症状態を促進します。食餌誘導性肥満 (DIO) はマクロファージの多様性; の役割を勉強の貴重なモデルただし、分離十分なマクロファージは炎症を起こした組織から取得する困難です。このプロトコルでは、私達は分離手順と必要なトラブルシューティングのガイドライン 18 週間の高脂肪 (HFD) または高脂肪高コレステロール (マウスから住民組織マクロファージの適切な人口を得るため私たちの研究から派生した輪郭を描くHFHCD) 食事介入。このプロトコルは、肥満や動脈硬化、肝、白色脂肪組織 (WAT)、大動脈などで学んだ 3 つのホールマーク組織に焦点を当てください。我々 はどのように二元的な使用を強調流れの cytometry 分離の新しいディメンションと住民組織マクロファージの性質を達成できます。このプロトコルの基本的なセクションは、フローサイトメトリーによる解析の染色後の細胞表面抗体とマクロファージの分離、組織固有の酵素の消化力の基になる複雑さを扱います。このプロトコルは、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えの基になる既存の複雑さに対処し、適切に並べ替えられた細胞集団から幅広い評価を得られるようにこれらの複雑さへの明確化を提案します。豊かな代替メソッドは、並べ替え FACS を操作するときの柔軟性と時間の管理を可能にする高密度の肝臓などの細胞に含まれています。簡単に言えば、このプロトコルを特定の研究では炎症を起こした組織の多数のマクロファージの不均一性を評価する研究者を助けるし、良好な細胞の単離と解析の成功している洞察力のトラブルシューティングのヒントを提供しますDIO を介した炎症における免疫細胞。
Introduction
マウス モデルは、人間の病気の研究に広く使用されています。病気の状態のマウスから常駐細胞の適切な分離は、病1の病態を分子・細胞の貢献を理解するためのプラットフォームを提供できます。重要です 1 つの障害は、肥満です。肥満の発生率は、インスリン抵抗性と並行世界的に上昇、タイプ 2 の糖尿病、心血管疾患、脂肪肝疾患2,3を継続します。過剰栄養摂取はさらに減らされた身体活動4大動脈および肝臓などの末梢組織の細胞環境を変更することができます脂肪組織から発せられる変更された信号をトリガーによって偏っています。代謝恒常性のような混乱は、慢性低学年全身性炎症5の結果します。
古典的活性化マクロファージの白色脂肪組織 (WAT) の募集と同様に大動脈および肝臓に居住者だけでなく代謝シグナルの調節不全を開始、また炎症6,7を維持する示されています。大食細胞の表現型および機能の多様性は肥満の病因に強く関連付けられている関連する併存7。マクロファージ偏波の動的塑性進行を調整するアクティブ化された表現型の範囲と炎症8の解像度を展示するこれらの細胞が可能です。一方、古典的活性化 (M1) マクロファージは炎症の進展に関与している、あるいはマクロファージ (M2) が解像度と組織修復9,10に関連付けられています。
体は代謝ストレスを受けると白色脂肪組織が異常蓄積されます。拡張の脂肪組織を引き付ける、インスリン抵抗性、高血糖、最終的に 2 型糖尿病、インスリン抵抗性や高血糖11を促進するために通常の脂肪細胞機能を深く変更炎症細胞を保持 12。並行して、白色脂肪組織改造によって解放の炎症性反応では古典的活性化 (M1) 脂肪組織マクロファージ (Atm)13,14を浸透させた。この多細胞器官は肝4大動脈などの他の臓器の正常な機能を derails シグナルのカスケードを発揮します。
肝臓は、近くの調節不全ワット15発刺激への応答の適応代謝パワーハウスです。肝マクロファージまたは代謝の変化に対応した、クッパー細胞実質の両方を変換する炎症性サイトカインと非実質細胞表現型を分泌して組織リモデリングを促進します。肝臓への脂肪蓄積、炎症、過剰な細胞外マトリックス預金、壊死、肝臓障害の広い範囲に貢献して炎症性の侮辱は、非アルコール性脂肪性肝疾患に関連付けられている最終的な関数の損失次のよう16,17,18。
並行して侵害されたワットと肝機能、太い動脈累積動脈壁内の脂質、体は慢性的な代謝ストレス19を受けます。動脈の脂質の蓄積は、活性化された血管内皮細胞によるケモカイン分泌および単球20の後の採用をトリガーします。募集、一度単球増殖を区別するため、リポ蛋白を摂取、泡沫細胞になります。粥状動脈硬化を開始され、プロ炎症性活動による持続的な募集と組織マクロファージ脂質荷を積んだ。この動脈硬化の微小環境の中継細胞外と細胞内ストレス信号に屈して、これらマクロファージは、アポトーシスのシグナル伝達カスケードに従事しています。これらの泡の細胞が死ぬと、プラーク破裂、心筋梗塞や脳卒中につながる病巣の壊死性コアに満たされた脂質内容を貢献します。
総称して、マクロファージの表現型の多様性は一部ワット、肝臓、大動脈8,21などの調節不全組織における炎症性変化による肥満を調整します。特性の採用し、組織マクロファージは、大食細胞の表現型の1を操作する分子標的の可能性への洞察を提供すること。効果的に炎症を起こした組織の肥満によるマクロファージを特徴付ける、酵素消化による単一細胞懸濁液が得られます。このような分離のプロトコルは免疫細胞死を最小限に抑えながら、最適な細胞収率を提供する結合組織を十分に分解に効果的である必要があります。酵素の混合、組織とその構造のメイクアップの種類に依存します。大動脈など弾力性のある組織では、肝組織の解離を達成するためにワットと比較してより強力な酵素活性を必要があります。単一細胞懸濁液から組織マクロファージが明確に特徴するまたは、転写プロファイリングなどさらに下流解析の分離します。
ここで組織固有のプロトコルは説明を効果的に分離し、伝統的な食生活による肥満、住民組織マクロファージを特徴付けるコラゲナーゼ依存組織消化と多色フローサイトメトリーを使用します。アテローム性動脈硬化、単純な脂肪肝と肝炎マウス モデル。同時白血球 – (CD45 や CD11b) やマクロファージに対する抗体と細胞表面のマーカーの染色 (F4/80) 特定の抗原は、しばしばマクロファージ人口22を識別するために使用されます。蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えは、高純度でこれらの特定の集団を並べ替えるために使用する強力な戦略です。並べ替えられた人口は、表現型特異的遺伝子プロファイル (量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応) などの下流の分子分析23を使用して評価できます。標準フローサイトメトリー ・ フロー フローサイトメトリーを用いた細胞のソーティングは非常に異種細胞懸濁液内マクロファージを区別する強力なツールであるが、正常な出力を確保するため元のプロトコルを最適化する必要があります。本研究では効果的に分離し、実行可能なティッシュ特定の大食細胞を特徴付けるプロトコルを説明します。もっと重要なは、この研究は、しばしば発生を防ぐおよび/またはそれらを解決するプロアクティブとトラブルシューティング戦略だけでなく、技術的な問題に重要な洞察を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
病気の進行の分子メカニズムを理解するアテローム性動脈硬化、単純な脂肪肝、肝炎などの併存を模倣し、タイプ 2 の糖尿病の食事誘発代謝性疾患モデルが採用されます。コラゲナーゼの消化力依存は細胞外マトリックス (ECM)16,27から細胞を解放するために組織を分離するによく使用されます。コラゲナーゼなどの酵素は、隣接する細胞の構造的な…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ペンシルベニア州立大学ミレニアム科学複雑な流れの Cytometry 中核施設に感謝したいと思います。
Materials
| 26G x 5/8 in Needles | BD | 305115 | |
| 23G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set | BD | 367297 | Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion |
| 21G 1 1/2 in. Needles | BD | 305156 | |
| 1mL syringe with rubber stops | BD | 309659 | |
| 10mL Syringes | BD | 309604 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| F4/80 PE | Biolegend | 123110 | |
| CD11c PE/Cy7 | Biolegend | 117318 | |
| CD11b PE/Cy5 | eBioscience | 15-0112-81 | |
| Anti-mouse CD16/32 Fc Block | Biolegend | 101320 | |
| CD45 Pacific Blue | Biolegend | 103126 | |
| PE Rat IgG2a | Biolegend | 400508 | |
| PE/Cy7 Armenian Hamster IgG | Biolegend | 400922 | |
| PE/Cy5 Rat IgG2b | Biolegend | 400610 | |
| Pacific Blue Rat IgG2c | Biolegend | 400717 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 15-017-CV | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |
| 70 micron cell strainers | Corning, Inc. | 352350 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16X | Electron Microscopy Sciences | CAS #30525-89-4 | |
| Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23mm, Sharp | Stoelting | 52132-10P | Used for general dissecting purposes |
| Micro Forceps, 4in, full curve, 0.8mm | Stoelting | 52102-37P | Used for general dissecting purposes |
| Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge | Fine Science Tool | 15000-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Curved 0.07 x 0.04 mm Tip Forceps | Fine Science Tool | 11297-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Hemostatic Forceps (Curved) | Fine Science Tool | 13021-12 | |
| Heparin Sodium Salt | Fischer Scientific | 9041-08-1 | |
| 35mm Cell Culture/Petri Dishes | Fischer Scientific | 12-565-90 | |
| Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid | Fischer Scientific | 08-757-100D | |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-959-53A | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| 5mL Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fischer Scientific | 14-959-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) | Millipore | EX0285-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Rockland | BSA-50 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Collagenasse Type XI | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Hyaluronidase Type I | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| 500mL beaker | Sigma Aldrich | 02-540M | |
| 4 cm Hemostatic clamp | Stoelting | 52120-40 | |
| Toothed forceps | Stoelting | 52104-33P | |
| 50 micron Disposable filters | Systemex | 04-0042-2317 | |
| Collagenase Type IV | ThermoFischer Scientific | 17104019 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) | ThermoFischer Scientific | A1049201 | |
| Razors (0.22 mm (0.009")) | VWR International | 55411-050 | |
| Texas Red Live/Dead stain | Red viability stain (in Figure 1A) |
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