Denne protokollen tillater forsker å isolere og karakterisere vev-resident makrofager i ulike hallmark betent vev utvunnet fra kosthold-indusert modeller av metabolske forstyrrelser.
Fedme fremmer en kronisk inflammatorisk stat som er i stor grad formidlet av vev-resident makrofager samt monocytt-avledet makrofager. Diett-indusert fedme (DIO) er en verdifull modell studere rollen macrophage heterogenitet; tilstrekkelig macrophage isolasjoner er imidlertid vanskelig å skaffe fra betent vev. I denne protokollen skissere vi isolasjon trinnene og nødvendig retningslinjer for feilsøking avledet fra våre studier for å få en passende befolkning på vev-resident makrofager fra mus etter 18 uker høy fett (HFD) eller høy-fett/høy-kolesterol ( HFHCD) kosthold intervensjon. Denne protokollen fokuserer på tre hallmark vev i fedme og åreforkalkning inkludert leveren og hvite liggende under adipose vev (WAT) aorta. Vi markere hvor dualistiske bruk av cytometri kan oppnå en ny dimensjon av isolering og karakterisering av vev-resident makrofager. En grunnleggende del av denne protokollen adresser vanskelighetene underliggende vev-spesifikke enzymatisk digestions og macrophage isolasjon og påfølgende celle-overflate antistoff flekker for flyt cytometric analyse. Denne protokollen adresser eksisterende kompleksiteten underliggende fluorescerende-aktivert celle sortering (FACS) og presenterer avklaringer til disse kompleksiteten for bredt spekter karakterisering fra tilstrekkelig sorterte celle populasjoner. Alternative berikelse metoder er inkludert for sortering celler, for eksempel tett leveren, gir fleksibilitet og tid når du arbeider med FACS. I korthet, denne protokollen hjelpemidler forskeren evaluere macrophage heterogenitet fra en rekke betent vev i en gitt studie og tilbyr innsiktsfulle feilsøkingstips som har vært vellykket for gunstige mobilnettet isolering og karakterisering av immunceller i DIO-mediert betennelse.
Musen modeller har blitt brukt til å studere dynamikken i menneskelig sykdommer. Riktig isolasjon av vev bosatt celler fra mus i en sykelig tilstand kan gi en plattform for å forstå den molekylære og mobilnettet bidrag til patogenesen av sykdom1. En lidelse som er av avgjørende betydning er fedme. Forekomsten av fedme fortsetter å stige over hele verden sammen med insulinresistens og type 2 diabetes mellitus, hjerte-og karsykdommer og fatty leversykdom2,3. Overdreven næringsstoffet forbruk ytterligere forvrenges av redusert fysisk aktivitet utløser endret signaler fra fettvev, som kan endre andre perifere vev som aorta og lever4mobilnettet miljøet. Slike avbrudd i metabolske homeostase resulterer i en kronisk lav karakter systemisk betennelse5.
Klassisk aktivering av makrofager bosatt aorta og leveren samt rekruttering til hvit fettvev (WAT) har vist seg å ikke bare starte feilregulering metabolske signaler, men også opprettholde betennelse6,7. Den fenotypiske og funksjonell mangfold i makrofager er sterkt assosiert med patogenesen av fedme relatert Co-morbidities7. Dynamisk plastisitet i macrophage polarisering gjør for disse cellene til å vise en rekke aktivert fenotyper som koordinerer utviklingen og oppløsning av betennelse8. Mens klassisk aktivert (M1) makrofager er innblandet i utbredelsen av betennelse, er alternativt aktivert (M2) makrofager forbundet med oppløsning og tissue reparasjon9,10.
Som kroppen gjennomgår metabolske stress, akkumuleres hvit fettvev unormalt. Utvidet fettvev tiltrekker og beholder inflammatoriske celler som dypt endre normal adipocyte funksjonen for å fremme insulinresistens, hyperglykemi og til slutt type 2 diabetes mellitus, insulinresistens eller hyperglykemi11, 12. Parallelt, hvit fettvev remodels svar på inflammatorisk signaler utgitt av infiltrert klassisk aktivert (M1) fettvev makrofager (ATMs)13,14. Denne multi-mobilnettet organ utøver en kaskade av signaler at derails normal funksjon av andre kroppens organer som aorta og leveren4.
Leveren er en metabolsk kraftpakke som tilpasser seg i respons på stimuli fra nærliggende dysregulated WAT15. Hepatic makrofager eller Kupffer celler, svar på metabolske forandringer, skiller inflammatoriske cytokiner som transformerer både parenchymal og ikke-parenchymal celle fenotypen og fremme vev remodeling. Hepatic lipid akkumulering, betennelse, overdreven ekstracellulær matrix innskudd, nekrose og eventuell funksjonen tap følger inflammatorisk fornærmelser bidra til bredt spekter av leverskader tilknyttet alkoholfrie fatty leversykdom 16,17,18.
Parallelt med kompromittert WAT og leverfunksjon akkumuleres store arterier lipider i arterieveggen som kroppen gjennomgår kronisk metabolsk stress19. Arterial lipid akkumulering utløser utskillelsen av chemokines av aktivert endotelceller og påfølgende rekruttering av monocytter20. Når rekruttert, monocytter sprer, skille, ingest lipoproteiner og bli skum celler. Atherogenesis er initiert og opprettholdes av pro-inflammatoriske aktiviteten rekruttert og vev bosatt lipid-laden makrofager. Succumbing til ekstracellulære og intracellulær stressignaler videreformidlet i denne atherogenic microenvironment, delta disse makrofager deretter i en apoptotisk signalering cascade. Som disse skum cellene dør, bidrar lipid fylt innholdet til nekrotisk kjernen av lesjonen, som så fører til plakk brudd, hjerteinfarkt og hjerneslag.
Kollektivt, orkestrerer heterogeniteten macrophage fenotyper delvis fedme indusert av inflammatoriske endringer observert i dysregulated vev som WAT, lever og aorta8,21. Karakteristikk av rekruttert og vev bosatt makrofager kan gi innsikt i potensielle molekylære mål som manipulere macrophage fenotypen1. Effektivt betegner makrofager fra fedme-indusert betent vev, kan en enkeltcelle suspensjon oppnås gjennom enzymatisk fordøyelsen. Slike dissosiasjon protokollene må være effektiv i tilstrekkelig nedverdigende bindevev samtidig minimere immun celledød og gir optimale celle avkastning. Enzym blandingen er avhengig av vev og dens strukturelle utgjør. Robust vev som aorta krever sterkere enzymatisk aktivitet, i forhold til leveren og WAT, å oppnå vev dissosiasjon. Fra enkelt celle suspensjon, kan vev bosatt makrofager utvetydig preget eller isolert for videre nedstrøms analyser som transcriptional profilering.
Her er en vev-spesifikk protokoll beskrevet som collagenase-avhengige vev fordøyelsen og polykromatisk flowcytometri til å effektivt isolere og karakterisere vev-resident makrofager fra tradisjonelt kosthold indusert fedme, aterosklerose, enkel Steatose og steatohepatitis musen modeller. Samtidige farging av cellen overflate markører med antistoffer mot leukocytter-(CD45 og/eller CD11b) og macrophage – (F4/80) bestemt antigener er ofte brukt til å identifisere macrophage bestander22. Fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS) er en kraftig strategi brukes sortere populasjonene identifisert på høy renhetsgrad. Sorterte befolkningen kan deretter bli vurdert for fenotypen bestemte genet profiler som bruker nedstrøms molekylær analyse (for eksempel kvantitative sanntid polymerasekjedereaksjons)23. Selv om standard flowcytometri og flyt cytometri-baserte celle sortering er kraftige verktøy i atskillende makrofager i en svært heterogen celle suspensjon, må tidligere protokollene være optimalisert for å sikre vellykket utgang. I denne studien beskrevet som effektivt isolere og karakterisere levedyktig vev bestemt makrofager; enda viktigere, gir denne studien viktig innsikt i tekniske problemer som ofte oppstår, og proaktiv og feilsøking strategier for å hindre og/eller løses.
Diett-indusert stoffskiftesykdom modeller som etterligner Co-morbidities som åreforkalkning, enkel Steatose, steatohepatitis og type 2 diabetes er mye brukt for forstå underliggende molekylære mekanismer av sykdomsprogresjon. Collagenase avhengige fordøyelsen brukes ofte til å distansere vev å frigjøre celler fra ekstracellulær matrix (EFM)16,27. Enzymer som collagenase forstyrre kollagen som gir strukturell støtte for omkringliggende celler. Vev struktu…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Flow cytometri Core anlegget på The Pennsylvania State University Millennium Science Complex.
26G x 5/8 in Needles | BD | 305115 | |
23G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set | BD | 367297 | Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion |
21G 1 1/2 in. Needles | BD | 305156 | |
1mL syringe with rubber stops | BD | 309659 | |
10mL Syringes | BD | 309604 | |
1mL Syringe | BD | 309659 | |
F4/80 PE | Biolegend | 123110 | |
CD11c PE/Cy7 | Biolegend | 117318 | |
CD11b PE/Cy5 | eBioscience | 15-0112-81 | |
Anti-mouse CD16/32 Fc Block | Biolegend | 101320 | |
CD45 Pacific Blue | Biolegend | 103126 | |
PE Rat IgG2a | Biolegend | 400508 | |
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG | Biolegend | 400922 | |
PE/Cy5 Rat IgG2b | Biolegend | 400610 | |
Pacific Blue Rat IgG2c | Biolegend | 400717 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 15-017-CV | |
1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |
70 micron cell strainers | Corning, Inc. | 352350 | |
1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16X | Electron Microscopy Sciences | CAS #30525-89-4 | |
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23mm, Sharp | Stoelting | 52132-10P | Used for general dissecting purposes |
Micro Forceps, 4in, full curve, 0.8mm | Stoelting | 52102-37P | Used for general dissecting purposes |
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge | Fine Science Tool | 15000-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
Curved 0.07 x 0.04 mm Tip Forceps | Fine Science Tool | 11297-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
Hemostatic Forceps (Curved) | Fine Science Tool | 13021-12 | |
Heparin Sodium Salt | Fischer Scientific | 9041-08-1 | |
35mm Cell Culture/Petri Dishes | Fischer Scientific | 12-565-90 | |
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid | Fischer Scientific | 08-757-100D | |
15mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-959-53A | |
50mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
5mL Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fischer Scientific | 14-959-5 | |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) | Millipore | EX0285-1 | |
Bovine Serum Albumin | Rockland | BSA-50 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
Collagenasse Type XI | Sigma-Aldrich | C7657 | |
Hyaluronidase Type I | Sigma-Aldrich | H3506 | |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
Collagenase Type I | Sigma-Aldrich | C0130 | |
NaOH | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
500mL beaker | Sigma Aldrich | 02-540M | |
4 cm Hemostatic clamp | Stoelting | 52120-40 | |
Toothed forceps | Stoelting | 52104-33P | |
50 micron Disposable filters | Systemex | 04-0042-2317 | |
Collagenase Type IV | ThermoFischer Scientific | 17104019 | |
Ammonium Chloride Potassium (ACK) | ThermoFischer Scientific | A1049201 | |
Razors (0.22 mm (0.009")) | VWR International | 55411-050 | |
Texas Red Live/Dead stain | Red viability stain (in Figure 1A) |