Изоляция, характеристика и очистки макрофагов из пострадавших от связанных с ожирением воспаление тканей
Summary
Этот протокол позволяет исследователю изолировать и характеризуют ткани резидентов макрофаги в различных hallmark воспаленных тканей, извлеченные из диеты индуцированной модели метаболических расстройств.
Abstract
Ожирение способствует хронические воспалительные государство, которое во многом опосредовано макрофагов ткани резидентов, а также моноцитарных макрофагов. Диета индуцированной ожирение (DIO) является полезной моделью в изучении роли неоднородности макрофагов; Однако адекватные макрофагов изоляции трудно приобрести из воспаленных тканей. В этом протоколе мы наметим шаги изоляции и необходимого руководства по устранению проблем, производный от наших исследований для получения подходящей населения макрофагов ткани резидентов от мышей после 18 недель высокой жирностью (HFD) или высокой жира/высокий холестерина ( Диетические вмешательство HFHCD). Этот протокол фокусируется на три пробы тканей, учился в ожирение, атеросклероз, включая печень, белой жировой ткани (Ват) и аорты. Мы подчеркиваем как дуалистической использование потока цитометрии можно добиться новое измерение изоляции и характеристика тканей резидентов макрофаги. Основной раздел настоящего протокола адреса тонкости лежащие в основе ткани конкретных ферментативного пищеварения и макрофагов изоляции и последующих клетк поверхности антитело пятная для анализа потока гранулярных. Этот протокол адреса существующих сложностей, лежащих в основе активированного люминесцентные клеток, сортируя (FACS) и представлены разъяснения этих сложностей, с тем чтобы получить широкий диапазон характеристик от адекватно отсортированный клеточных популяций. Методы альтернативной обогащения включены для сортировки клеток, например, плотная печень, позволяя для гибкости и времени управления при работе с СУИМ. Короче говоря этот протокол СПИД исследователь оценить неоднородность макрофагов из множества воспаленных тканей в рамках данного исследования и обеспечивает проницательные советы по устранению неполадок, которые оказались успешными для благоприятного сотовой изоляции и характеристика иммунных клеток в Дио опосредованной воспаления.
Introduction
Мышь модели широко используются для изучения динамики заболеваний человека. Надлежащая изоляция резидентов клеток ткани от мышей в состоянии больной может обеспечить платформу для понимания молекулярная и клеточная вклад в патогенезе заболевания1. Одно расстройство, которое имеет решающее значение является ожирение. Распространенность ожирения продолжает расти во всем мире параллельно с сопротивлением инсулина и типа 2 диабет, сердечно-сосудистых заболеваний и жировой болезни печени2,3. Чрезмерное потребление питательных веществ далее перекос, снижение физической активности, вызывая изменения сигналов, вытекающих из жировой ткани, который может изменить клеточного окружения других периферийных тканей, таких как аорты и печени4. Такие нарушения метаболизма гомеостаза приводит к хронической низкосортных внутрирастительного воспаления5.
Классическая активация макрофагов, резидент в аорту и печени, а также их вербовки в белой жировой ткани (Ват) было показано не только инициировать регуляции метаболических сигналов, но также поддерживать воспаление6,7. Фенотипические и функциональных неоднородность макрофагов прочно ассоциируется с патогенезе ожирения связаны сопутствующие заболевания7. Динамический пластичности в макрофагов поляризации позволяет эти клетки демонстрируют широкий спектр активированные фенотипов, которые координируют прогрессии и резолюции воспаления8. В то время как классически Активированные макрофаги (M1) вовлечены в распространении воспаления, альтернативно Активированные макрофаги (м2) были связаны с резолюцией и ткани ремонт9,10.
Как тело испытывает метаболический стресс, аномально накапливается белой жировой ткани. Расширенный жировой ткани привлекает и удерживает воспалительные клетки, которые глубоко изменить функции нормальной Адипоцит содействовать сопротивление инсулина, гипергликемия и в конечном итоге сахарный диабет типа 2, сопротивление инсулина или гипергликемия11, 12. Параллельно белой жировой ткани переделывает в ответ на воспалительные сигналы, выпущенное проникли классически активированные (M1) жировой ткани макрофагами (банкоматов)13,14. Этот многоклеточной орган оказывает Каскад сигналов, derails нормальной функции других органов тела, например, аорта и печени4.
Печень является метаболически электростанция, которая адаптируется в ответ на раздражители, происходящих из близлежащих dysregulated Ват15. Макрофагами печени или клеток Купфера, в ответ на метаболические изменения, выделяют воспалительных цитокинов, что преобразования как Паренхиматозный и фенотип не Паренхиматозный клеток и содействовать тканей ремоделирования. Накопление липидов в печени, воспаление, депозиты чрезмерно внеклеточного матрикса, некроз и возможные функции потерь следует воспалительных оскорбления, предоставляющих широкий спектр повреждения печени, связанные с безалкогольных жирная болезнь печени 16,17,18.
Параллельно с нарушенной Ват и функции печени крупные артерии накапливаться липидов в стенке артерий, как тело испытывает хронический метаболический стресс19. Накопление липидов артериальной вызывает секрецию chemokines активированный эндотелиальных клеток и последующего набора моноциты20. После вербовки, моноциты размножаться, дифференцировать, глотать липопротеинов и стать пены клетки. Атерогенеза инициируется и устойчивого про воспалительных деятельности набранных и тканевых макрофагов резидентов липидов Ладена. Поддаваясь внеклеточные и внутриклеточных стресс сигналы передаются в этом атерогенные микроокружения, эти макрофаги затем заниматься apoptotic сигнальный Каскад. Как эти пены клетки умирают, они способствуют их содержание липидов заполнены на ядро некротические поражения, которое затем приводит к разрыву зубного налета, инфаркта миокарда и инсульта.
Коллективно неоднородность фенотипов макрофагов в части оркеструет ожирения, вызванных воспалительные изменения, наблюдаемые в dysregulated ткани, такие как Ват, печень и аорты8,21. Характеристику набранных и ткани-резидентов макрофаги могут обеспечить понимание потенциальных молекулярных целей, которые манипулируют макрофагов фенотип1. Эффективно охарактеризовать макрофаги от ожирения индуцированной воспаленных тканей, подвески одной ячейки можно получить путем ферментативного пищеварения. Такие протоколы диссоциации должна быть эффективной в достаточно унижающего достоинство соединительной ткани при минимизации иммунных клеток смерть и обеспечивая оптимальное ячейки урожайности. Смесь ферментов зависит от типа ткани и ее структурных составляющих. Эластичных тканей, таких как аорты требует сильнее ферментативную активность, по сравнению с печени и Ват, для достижения ткани диссоциации. От одноклеточного подвеска резидентов макрофаги ткани может быть однозначно характеризуется или изолированные для дополнительного течению анализа, таких как транскрипционный анализ профиля.
Здесь ткани конкретного протокол описан, использующий коллагеназы зависимых тканей пищеварение и полихромный проточной цитометрии эффективно изолировать и характеризуют ткани резидентов макрофаги, полученные от традиционного рациона индуцированной ожирения, атеросклероз, простой стеатоз и стеатогепатит мыши модели. Одновременная окрашивания клеток поверхности маркеров с антителами против лейкоцита-(CD45 или CD11b) и макрофагов – специфических антигенов (F4/80), часто используется для идентификации макрофагов населения22. Активирован флуоресценции клеток, сортируя (FACS) является мощной стратегией, используемый для сортировки этих выявленных подвергающегося высокой чистоты. Отсортированный населения можно затем оценить фенотип профилей конкретных генов с помощью течению молекулярного анализа (например, количественные реального времени полимеразной цепной реакции)23. Хотя стандартные проточной цитометрии и сортировки потока на основе цитометрии клеток являются мощными инструментами в отличительный макрофагов в суспензии значительно гетерогенных клеток, бывший протоколы должны быть оптимизированы для обеспечения успешного вывода. В этом исследовании описываются протоколы, которые эффективно изолировать и характеризуют конкретные жизнеспособных тканевых макрофагов; что еще более важно это исследование обеспечивает решающую понимание технических вопросов, которые часто возникают, а также активную и неисправностей стратегии предотвращения и/или их решения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы лучше понять глубинные механизмы прогрессирования заболевания широко используются модели диета индуцированной метаболические расстройства, которые имитируют сопутствующие заболевания, таких как атеросклероз, простой стеатоз, стеатогепатитом и диабета типа 2. Коллагеназы зав?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить объекта потока Core цитометрии в Пенсильвании государственного университета тысячелетия науки комплекса.
Materials
| 26G x 5/8 in Needles | BD | 305115 | |
| 23G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set | BD | 367297 | Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion |
| 21G 1 1/2 in. Needles | BD | 305156 | |
| 1mL syringe with rubber stops | BD | 309659 | |
| 10mL Syringes | BD | 309604 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| F4/80 PE | Biolegend | 123110 | |
| CD11c PE/Cy7 | Biolegend | 117318 | |
| CD11b PE/Cy5 | eBioscience | 15-0112-81 | |
| Anti-mouse CD16/32 Fc Block | Biolegend | 101320 | |
| CD45 Pacific Blue | Biolegend | 103126 | |
| PE Rat IgG2a | Biolegend | 400508 | |
| PE/Cy7 Armenian Hamster IgG | Biolegend | 400922 | |
| PE/Cy5 Rat IgG2b | Biolegend | 400610 | |
| Pacific Blue Rat IgG2c | Biolegend | 400717 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 15-017-CV | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |
| 70 micron cell strainers | Corning, Inc. | 352350 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16X | Electron Microscopy Sciences | CAS #30525-89-4 | |
| Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23mm, Sharp | Stoelting | 52132-10P | Used for general dissecting purposes |
| Micro Forceps, 4in, full curve, 0.8mm | Stoelting | 52102-37P | Used for general dissecting purposes |
| Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge | Fine Science Tool | 15000-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Curved 0.07 x 0.04 mm Tip Forceps | Fine Science Tool | 11297-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Hemostatic Forceps (Curved) | Fine Science Tool | 13021-12 | |
| Heparin Sodium Salt | Fischer Scientific | 9041-08-1 | |
| 35mm Cell Culture/Petri Dishes | Fischer Scientific | 12-565-90 | |
| Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid | Fischer Scientific | 08-757-100D | |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-959-53A | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| 5mL Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fischer Scientific | 14-959-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) | Millipore | EX0285-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Rockland | BSA-50 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Collagenasse Type XI | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Hyaluronidase Type I | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| 500mL beaker | Sigma Aldrich | 02-540M | |
| 4 cm Hemostatic clamp | Stoelting | 52120-40 | |
| Toothed forceps | Stoelting | 52104-33P | |
| 50 micron Disposable filters | Systemex | 04-0042-2317 | |
| Collagenase Type IV | ThermoFischer Scientific | 17104019 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) | ThermoFischer Scientific | A1049201 | |
| Razors (0.22 mm (0.009")) | VWR International | 55411-050 | |
| Texas Red Live/Dead stain | Red viability stain (in Figure 1A) |
Riferimenti
- Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (12), 840-846 (2006).
- Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (12), 875-880 (2006).
- Jung, U., Choi, M. -. S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).
- Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
- Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).
- Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).
- Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).
- Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).
- Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).
- Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).
- Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
- Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).
- Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).
- Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).
- Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
- Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).
- Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174 (2014).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848 (2011).
- Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, 247-252 (2014).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).
- Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).
- Yu, Y. R. A., O’Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).
- Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).
- Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).
- Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
- Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).
- Kim, Y. -. J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).
- Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6 (3), 13 (2014).
- Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).
- Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).
