התאוששות נייד באמצעות פרופילים תוכן גבוהה מיקרוסקופית
Summary
מאמר זה מציג עבודה תוכן גבוהה מיקרוסקופ לכימות בו זמנית של רמות ROS תאיים, כמו גם פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריה ומורפולוגיה – המכונים במשותף כמו morphofunction המיטוכונדריה – בתאים חסיד חיים באמצעות מולקולרית פלואורסצנטי חוברת מולקולות כתב 5- (ו – 6) -כלורומיליל -2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, אסתר אצטיל (CM-H 2 DCFDA) ו tetramethylrhodamine methylester (TMRM).
Abstract
מינים חמצן תגובתי (ROS) מווסתים תהליכים תאיים חיוניים, כולל ביטוי גנטי, הגירה, הבחנה והתפשטות. עם זאת, רמות ROS מוגזמות לגרום למצב של מתח חמצוני, אשר מלווה בנזק חמצוני בלתי הפיך ל- DNA, שומנים וחלבונים. לפיכך, כימות של ROS מספק פרוקסי ישיר למצב הבריאות הסלולרית. מאז המיטוכונדריה הם בין המקורות הסלולר העיקריים ומטרות של ROS, ניתוח משותף של תפקוד המיטוכונדריה ו ROS הייצור באותם תאים הוא חיוני להבנה טובה יותר של הקישוריות בתנאים פתופיזיולוגיים. לכן, אסטרטגיה גבוהה מבוסס מיקרוסקופ אסטרטגיה שפותחה עבור כימות בו זמנית של רמות ROS תאיים, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה (ΔΨ מ ' ) ומורפולוגיה המיטוכונדריה. הוא מבוסס על מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומאטי widefield וניתוח תמונה של תאים חסיד חיים, גדל צלחות רב, וכן staineD עם חדיר תאים חדיר מולקולות פלורסנט CM-H 2 DCFDA (ROS) ו TMRM (ΔΨ מ ו מורפולוגיה המיטוכונדריה). בניגוד fluorimetry או זרימת cytometry, אסטרטגיה זו מאפשרת כימות הפרמטרים subcellular ברמה של תא בודד עם רזולוציה גבוהה spatiotemporal, הן לפני ואחרי גירוי ניסיוני. חשוב לציין, את האופי מבוסס התמונה של השיטה מאפשרת לחלץ פרמטרים מורפולוגיים בנוסף עוצמת האות. מערך התכונות המשולב משמש לניתוח נתונים רב-משתני וניתוח סטטיסטי כדי לזהות הבדלים בין תת-אוכלוסיות, סוגי תאים ו / או טיפולים. הנה, תיאור מפורט של assay מסופק, יחד עם ניסוי לדוגמה זה מוכיח את הפוטנציאל שלה לאפליה חד משמעית בין מדינות הסלולר לאחר הפרעה כימית.
Introduction
ריכוז של ROS תאיים הוא מוסדר בקפידה באמצעות אינטראקציה דינמית בין ROS לייצר ROS מערכות defusing. חוסר איזון בין שני מעורר מצב של מתח חמצוני. בין המקורות העיקריים של ROS הם המיטוכונדריה 1 . בהינתן תפקידם בנשימה התאית, הם אחראים על חלק הארי של מולקולות הסופר-חמצן הבין-תאיות (O 2 – – ). זה נובע בעיקר דליפת אלקטרונים O 2 ב 1 מורכבים של שרשרת התחבורה האלקטרון בתנאים של פוטנציאל פנימי שלילי מיטוכונדריאלי שלילי (Δψ מ ' ), כלומר hyperpolarization המיטוכונדריה. מצד שני, dololarization המיטוכונדריה יש גם מתואמים עם ייצור ROS מוגברת הצבעה על מצבים מרובים של פעולה 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . יתר על כן, באמצעות שינויים חזיון חלבונים של מנגנון היתוך ביקוע, ROS שיתוף להסדיר מורפולוגיה המיטוכונדריה 9. לדוגמה, פיצול הוא בקורלציה עם ייצור ROS גדל אפופטוזיס 10 , 11 , בעוד המיטוכונדריה נימי נקשרו הרעב התזונתי והגנה מפני מיטופגי 12 . לאור היחסים המורכבים בין ROS הסלולר morphofunction המיטוכונדרי, שניהם באופן אידיאלי צריך לכמת בו זמנית בתאים חיים. כדי לעשות בדיוק את זה, assay הדמיה תוכן גבוהה פותחה על בסיס מיקרוסקופ widefield אוטומטיות וניתוח תמונה של תרבויות תא חסיד מוכתם בדיקות פלורסנט CM-H 2 DCFDA (ROS) ו TMRM (מיטוכונדריאלי Δψ מ ומורפולוגיה). הדמיה בתוכן גבוה מתייחסת להפקת spAtiotemporally עשיר ( כלומר , מספר גדול של תכונות תיאוריות) מידע על פנוטיפים הסלולר באמצעות מספר סמנים משלימים וניתוחי תמונה אוטומטיים. בשילוב עם מיקרוסקופיה אוטומטית דגימות רבות ניתן לוקרן במקביל ( כלומר , תפוקה גבוהה), ובכך להגדיל את הכוח הסטטיסטי של assay. ואכן, הנכס העיקרי של הפרוטוקול הוא שהוא מאפשר כימות בו זמנית של פרמטרים מרובים בתא זהה, וזאת עבור מספר רב של תאים ותנאים.
פרוטוקול מחולק 8 חלקים (המתואר בפירוט בפרוטוקול להלן): 1) תאים זורעים בצלחת 96-היטב; 2) הכנת פתרונות מלאי, פתרונות עבודה ומאגר הדמיה; 3) הגדרת המיקרוסקופ; 4) טוען של תאים עם CM-H 2 DCFDA ו TMRM; 5) הראשון הדמיה חיה כדי למדוד את רמות הבסיס ROS ו morphofunction המיטוכונדריה; 6) סיבוב הדמיה חיה שנייה לאחר תוספת של tert -butyl(TBHP) כדי למדוד רמות ROS המושרה; 7) ניתוח תמונה אוטומטי; 8) ניתוח נתונים, בקרת איכות ויזואליזציה.
Assay פותחה במקור עבור fibroblasts נורמלי אנושי (NHDF). מאז תאים אלה גדולים ושטוחים, הם מתאימים גם להערכת מורפולוגיה המיטוכונדריאלי בתמונות widefield 2D 13 , 14 . עם זאת, עם שינויים קלים, שיטה זו חלה על סוגי תאים אחרים חסיד. יתר על כן, ליד השילוב של CM-H 2 DCFDA ו TMRM, זרימת העבודה תואם מגוון רחב של זוגות צבע פלורסנט עם תכונות מולקולריות שונות 1 , 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה גבוהה תוכן מיקרוסקופ לכימות בו זמנית של רמות ROS תאיים ו morphofunction המיטוכונדרי ב NHDF. הביצועים שלה הודגם עם מקרה מבחן על SQV שטופלו NHDF. התוצאות תומכות בראיות מוקדמות יותר מהספרות שבהן רמות ROS גבוהות או תפקוד מיטוכונדריאלי נצפו לאחר טיפול במעכבי פרוטאז מסו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת אנטוורפן (TTBOF / 29267, TTBOF / 30112), קרן המחקר המיוחד של אוניברסיטת גנט (פרויקט BOF / 11267/09), NB-Photonics (קוד פרוייקט 01-MR0110) ו- CSBR עבור ביולוגיה של מערכות מחקר) יוזמה של הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO: לא: CSBR09 / 013V). חלקים מכתבי יד אלה הותאמו מפרסום אחר, באישורו של שפרינגר. המחברים מודים לחירט מייסן על עזרתו במיקרוסקופ.
Materials
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 ml | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1M 500mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20x objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
Riferimenti
- Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
- Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, 1-17 (2012).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
- Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
- Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
- Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
- Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
- Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics–mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
- Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
- Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
- Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
- Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , 474-485 (1994).
- Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. . shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , (2017).
- Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
- Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
- Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
- Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
- Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
- Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
- Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor–saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
- Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
- Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
- . Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006)
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
- Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
- Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O’Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
- Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
- Fercher, A., O’Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
- Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
- Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
- Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
