Cellular Redox Profiling ved hjelp av høy innholdsmikroskopi
Summary
I dette papiret presenteres en mikroprosess arbeidsflyt med høy innhold for samtidig kvantifisering av intracellulære ROS-nivåer, samt mitokondrielt membranpotensial og morfologi – i fellesskap referert til som mitokondriell morfofunksjon – i levende vedhengende celler ved bruk av celle-permeant fluorescerende reportermolekyler 5- (og- 6) -klorometyl-2 ', 7'-diklorodihydrofluoresceindiacetat, acetylester (CM-H2 DCFDA) og tetrametylrhodamin-metylester (TMRM).
Abstract
Reaktive oksygenarter (ROS) regulerer viktige cellulære prosesser, inkludert genuttrykk, migrasjon, differensiering og proliferasjon. Overdrivende ROS-nivåer induserer imidlertid en tilstand av oksidativt stress, som er ledsaget av irreversibel oksidativ skade på DNA, lipider og proteiner. Dermed gir kvantifisering av ROS en direkte proxy for cellulær helse tilstand. Siden mitokondrier er en av de viktigste cellene og målene for ROS, er felles analyse av mitokondriell funksjon og ROS-produksjon i de samme cellene avgjørende for bedre forståelse av sammenkoblingen i patofysiologiske forhold. Derfor ble det utviklet en mikroskopibasert strategi med høy innhold for samtidig kvantifisering av intracellulære ROS-nivåer, mitokondrielt membranpotensial (ΔΨ m ) og mitokondriell morfologi. Den er basert på automatisert widefield fluorescensmikroskopi og bildeanalyse av levende vedhengende celler, dyrket i multi-brønnplater og staineD med de celle-permeable fluorescerende reportermolekylene CM-H 2 DCFDA (ROS) og TMRM (ΔΨ m og mitokondriellmorfologi). I motsetning til fluorometri eller strømningscytometri, tillater denne strategien kvantifisering av subcellulære parametere på nivået av den enkelte celle med høy spatiotemporal oppløsning, både før og etter eksperimentell stimulering. Viktig er at den bildebaserte karakteren av metoden tillater utvinning av morfologiske parametere i tillegg til signalintensiteter. Det kombinerte funksjonssettet brukes til explorativ og statistisk multivariativ dataanalyse for å oppdage forskjeller mellom subpopulasjoner, celletyper og / eller behandlinger. Her er en detaljert beskrivelse av analysen gitt sammen med et eksempeleksperiment som viser sitt potensial for entydig diskriminering mellom cellulære tilstander etter kjemisk forstyrrelse.
Introduction
Konsentrasjonen av intracellulær ROS reguleres omhyggelig gjennom et dynamisk samspill mellom ROS-produserende og ROS-defusing-systemer. Ubalanse mellom de to fremkaller en tilstand av oksidativt stress. Blant de store kildene til ROS er mitokondrier 1 . Gitt deres rolle i cellulær respirasjon, er de ansvarlige for størstedelen av intracellulære superoksid (O 2 • – ) molekyler 2 . Dette skyldes for det meste elektronelekkasje til O 2 i kompleks 1 av elektrontransportkjeden under betingelser med sterkt negativt indre mitokondrielt membranpotensial (ψψ m ), dvs. mitokondriell hyperpolarisering. På den annen side har mitokondriell depolarisering også vært korrelert med økt ROS-produksjon som peker på flere virkemåter 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Videre, gjennom redoks-modifikasjoner i proteiner i fissionsfusjonsmaskinen, regulerer ROS med mitokondriell morfologi 9. For eksempel er fragmentering korrelert med økt ROS-produksjon og apoptose 10 , 11 , mens filamentøse mitokondrier har vært knyttet til næringsstøt og beskyttelse mot Mitofagi 12 . Gitt det intrikate forholdet mellom cellulær ROS og mitokondriell morfofunksjon, bør begge ideelt sett kvantifiseres samtidig i levende celler. For å utføre dette, ble det utviklet et høyverdig bildebehandlingsassay basert på automatisert widefieldmikroskopi og bildeanalyse av adherente cellekulturer farget med fluorescerende prober CM-H 2 DCFDA (ROS) og TMRM (mitokondriell ψψm og morfologi). Høyinnholds bildebehandling refererer til utvinning av spAtiotemporalt rik ( dvs. stort antall beskrivende egenskaper) informasjon om cellulære fenotyper ved hjelp av flere komplementære markører og automatiserte bildeanalyser. Når kombinert med automatisert mikroskopi, kan mange prøver screenes parallelt ( dvs. høy gjennomstrømning), og dermed øke den statistiske effekten av analysen. Faktisk er et hovedelement i protokollen at det muliggjør samtidig kvantifisering av flere parametere i samme celle, og dette for et stort antall celler og forhold.
Protokollen er delt inn i 8 deler (beskrevet i detalj i protokollen nedenfor): 1) Seeding celler i en 96-brønn plate; 2) Fremstilling av stamløsninger, arbeidsløsninger og bildebuffer; 3) Oppsett av mikroskop; 4) Lading av cellene med CM-H2 DCFDA og TMRM; 5) Første levende bildebehandlingsrunde for å måle basale ROS-nivåer og mitokondriell morfofunksjon; 6) Andre levende bildebehandlingsrunde etter tilsetning av tert -butylPeroxide (TBHP) for å måle induserte ROS-nivåer; 7) Automatisk bildeanalyse; 8) Dataanalyse, kvalitetskontroll og visualisering.
Analysen ble opprinnelig utviklet for normale humane dermal fibroblaster (NHDF). Siden disse cellene er store og flate, er de godt egnet for å vurdere mitokondriell morfologi i 2D widefieldbilder 13 , 14 . Imidlertid, med mindre endringer, er denne metoden gjeldende for andre vedhengende celletyper. Videre følger arbeidsflyten ved siden av kombinasjonen av CM-H 2 DCFDA og TMRM en rekke fluorescerende fargepar med forskjellige molekylære spesifisiteter 1 , 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papiret beskriver en mikroskopi med høy innhold for samtidig kvantifisering av intracellulære ROS-nivåer og mitokondriell morfofunksjon i NHDF. Dens ytelse ble demonstrert med en case-studie på SQV-behandlet NHDF. Resultatene støtter tidligere bevis fra litteraturen hvor økte ROS-nivåer eller mitokondriell dysfunksjon har blitt observert etter behandling med HIV-proteasehemmere av type 1, om enn i separate eksperimenter 19 , 20 , <sup cla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.
Materials
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 ml | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1M 500mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20x objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
Riferimenti
- Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
- Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, 1-17 (2012).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
- Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
- Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
- Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
- Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
- Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics–mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
- Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
- Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
- Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
- Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , 474-485 (1994).
- Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. . shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , (2017).
- Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
- Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
- Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
- Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
- Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
- Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
- Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor–saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
- Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
- Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
- . Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006)
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
- Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
- Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O’Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
- Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
- Fercher, A., O’Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
- Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
- Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
- Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
