نقدم هنا، بروتوكولا لاقتفاء أثر المجينية الحمض النووي (جدنا) التلوث في عينات الحمض النووي الريبي. تستخدم طريقة عرض محددة كبسولة تفجير للمنطقة الداخلية يدون مباعدة (البحث عن) ريبوسومال الحمض النووي (المتاشب) الجينات. الأسلوب مناسب للكشف عن التلوث الحمض النووي في معظم حقيقيات النوى وبدائيات النوى موثوقة والحساسة.
هو أسلوب واحد المستخدمة على نطاق واسع للتحديد الكمي لتغييرات التعبير الجيني ووفرة نسخة النسخ العكسي الكمي PCR الوقت الحقيقي (RT-qPCR). أنها توفر نتائج دقيقة وحساسة ويمكن الاعتماد عليها واستنساخه. عدة عوامل يمكن أن تؤثر على حساسية وخصوصية RT-قبكر. بقايا الحمض النووي (جدنا) تلويث عينات الحمض النووي الريبي واحد منهم. في تحليل التعبير الجيني، سوف نبالغ في وفرة مستويات نسخة التضخيم غير محددة بسبب تلوث جدنا ويمكن أن تؤثر على نتائج RT-قبكر. عموما، يتم الكشف عن جدنا ببكر qRT التمهيدي باستخدام أزواج الصلب إلى مناطق إينتيرجينيك أو إنترون الجينات للفائدة. ولسوء الحظ، شروح إنترون/إكسون ليست معروفة بعد لجميع الجينات من الفقريات والبكتيريا، طلائعيات، الفطريات، النباتات واللافقاريات الاستراحة.
نقدم هنا بروتوكولا للكشف عن التلوث جدنا في الحمض النووي الريبي العينات باستخدام الحمض النووي ريبوسومال (المتاشب)-على أساس الإشعال. الأسلوب الذي يستند إلى الخصائص الفريدة المتاشب: طبيعتها مولتيجيني وتسلسل المصانة عالية، وعالية التردد في الجينوم. أيضا كدراسة حالة، صممت استناداً إلى مجموعة فريدة من الإشعال في المنطقة المصانة ريبوسومال الحمض النووي (المتاشب) في الأسرة الفصيلة القبئيه. تم اختبار الطابع العالمي لهذه الأزواج التمهيدي قبل تذوب منحنى التحليل و [اغروس] هلام التفريد. على الرغم من أن يشرح لنا طريقة كيف يمكن تطبيقها على أساس المتاشب كبسولة تفجير لفحص التلوث جدنا في الأسرة الفصيلة القبئيه، فإنه يمكن استخدامها بسهولة للأنواع الأخرى بروكاريوتي ويوكاريوتي
استكشاف تنظيم النسخي للاهتمام مجموعات الجينات أو إشارات الشبكات ضروري لفهم الآليات الجزيئية المعقدة التي تشارك في الأحداث البيولوجية1. حاليا، يتم تحليل qPCR النهج الأكثر استخداماً للجينات التعبير الدراسات التي يمكن أن تستهدف أما من الحمض النووي (الجينوم) أو الحمض النووي الريبي (الترنسكربيتوم) التي تسمح بتحليل مثيلوم والترنسكربيتوم، على التوالي. النسخ العكسي (RT) تليها qPCR يستخدم على نطاق واسع لتحليل الترنسكربيتوم بقياس مستويات التعبير الجيني في مختلف مجالات البحوث البيولوجية2. بالمقارنة مع غيرها أساليب مثل التهجين الشمالية التقليدية، وكشف الأنسجة محددة عبر راحة التهجين وفحوصات حماية ribonuclease (الجيش الوطني الرواندي) وشبه–الرايت-بكر، الدقة، في الموقع ، وسرعة ودينامية واسعة النطاق من فحوصات على أساس قبكر هي رائعة جداً3،4. وهناك العديد من العوامل الهامة التي يجب أن تؤخذ لإجراء تقييم كمي موثوق لرسول الحمض النووي الريبي (مرناً)، بما في ذلك نوعية وكمية من الحمض النووي الريبي ابتداء من المواد. وعلاوة على ذلك، التضخيم غير محددة وكفاءة RT qPCR PCR الكفاءة يجب أن تؤخذ5،6.
وجود جدنا مشكلة متأصلة أثناء استخراج الحمض النووي الريبي يرجع، جزئيا، إلى الخصائص الفيزيائية والكيميائية مشابهة ل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي7. بسبب تسلسل هوية جدنا والحمض النووي التكميلية (كدنا) المستمدة من العينات مرناً، يمكن أن يحدث التضخيم غير محددة، التي ستؤثر على دقة نتائج RT-قبكر. جدنا المتبقية سوف يؤدي إلى المبالغة في تقدير الوفرة من استهداف مرناً في تحليل التعبير الجيني8.
أساسا، أمبليكون غير محددة معظمها ينبع من تشكيل ديمر التمهيدي أو التضخيم الخلفية غير محدد نظراً لجدنا، التي يمكن تقييمها باستخدام عينات المراقبة المناسبة. هذه العينات هي لا تحكم قالب (المجلس الوطني الانتقالي) ولا تحكم المنتسخة العكسية (النيكوتين)، على التوالي. حيث تختلف مستويات التلوث جدنا في العينات التي تجري دراستها والحساسية تجاه جدنا يختلف كثيرا بين الجينات تم تحليلها، الضوابط النيكوتين المطلوبة لكل زوج عينة/المقايسة. على الرغم من أن هذا زيادة كبيرة في التكلفة والعمل في دراسات RT-qPCR التنميط، هذه الضوابط هي المطلوبة7،9.
تتضمن أساليب بديلة التعامل مع التلوث جدنا استخدام أزواج التمهيدي الصلب إلى مناطق إينتيرجينيك أو إنترون الجينات لفائدة10، واستخدام كبسولة تفجير الجناح إنترون كبيرة أو تمتد عبر تقاطع إكسون-إكسون، أي مواقع انلينغ غائبة في مرناً ناضجة التسلسل1،4. ومع ذلك، إنترون/إكسون شروح لجميع الجينات من العديد من فقاريات والبكتيريا، طلائعيات، والفطريات، والنبات، واللافقاريات الاستراحة معروفة بعد. وبالإضافة إلى ذلك، لدى العديد من الكائنات الحية حقيقية النواة بسيودوجينيس المستمدة من أحداث ازدواجية. علاوة على ذلك، لا يضمن التصميم التمهيدي عبر introns غير تضخيم جدنا. كما الكروماتين إمكانية الوصول إلى مناطق الجينوم إلى الدناز أنا يختلف، من المستحسن لتصميم أزواج التمهيدي مختلفة تستهدف الكروموسومات مختلفة10.
يمكن أن تشمل الجينوم من الكائنات الحية حقيقية النواة تصل إلى ألف نسخة من الجينات المتاشب ترميز ريبوسومال مفارز اللازمة لتشكيل ريبوسوم. غالباً ما يتم تنظيم هذه الجينات المتاشب في صفيف مفرد أو تكرار tandem11. بوليسيسترونيك ررناس (الشكل 1) بما في ذلك وحدة فرعية كبيرة (LSU) ووحدة فرعية صغيرة (SSU) يتم نسخها من قبل رنا بوليميراز أنا (بول رنا أنا). كذلك تجهز قبل-ررناس الناتجة عن طريق القضاء على هاتين المنطقتين مباعدة يدون الداخلية ITS1 و ITS2. ثلاثة ناضجة كمنتجات نهائية، ررناس، 17-18S الرنا الريباسي (SSU)، 5.8S، و 25-28 الرنا الريباسي (LSU) هي ولدت12. الجينات المتاشب هم الممثلون نموذجي لعائلة مولتيجيني مع تسلسل المصانة عاليا. تحدث مع عالية تردد في الجينوم، ويحتمل أن تكون موجودة في أكثر من موقع الكروموسومات13. تجهيز الرنا الريباسي وتدهور الفواصل يدون عملية سريعة في نوية. نظراً للدرجة العالية من التكرار، هو أقل نسبة عدد النسخ الجينوم والاكتشاف بريموليكوليس الحمض النووي الريبي غير المجهزة بالمقارنة بتسلسل إنترون نسخة منخفضة والسلائف أونسبليسيد. هذه الميزات تجعل الجينات المتاشب مناسبة تماما للكشف عن التلوث جدنا في معظم حقيقيات النوى وبدائيات النوى3موثوقة وحساسة للغاية.
ويرد هنا إجراء جديداً للكشف عن التلوث جدنا في عينات الحمض النووي الريبي. وترد مجموعة من الإشعال العالمي استناداً إلى تسلسل المتاشب حفظت لفحوصات جدنا في العديد من أنواع الفصيلة القبئيه. خصوصية وعالمية الإشعال المقترحة خضعت لتحليل منحنى تذوب باستخدام الحمض النووي كقالب. لدينا البروتوكول لا ينطبق على الفصيلة القبئيه فقط، ولكن يمكن أيضا بسهولة أن تتكيف مع الأنواع الأخرى حقيقية النواة وبدائية.
تحليل التعبير الجيني PCR الكمي قد طبقت على نطاق واسع في السنوات الأخيرة. والفائدة الرئيسية من هذه الطريقة السريعة والفعالة من حيث التكلفة والآلي هو نتيجة دقيقة ودقيقة. ومع ذلك، الحصول على الفوائد المثلى من هذه المزايا يتطلب فهم واضح لإعداد المعلمات المستخدمة في التجربة qPCR. لتلقي نتيجة موثوق بها في تحليل التعبير الجيني قبكر، من الضروري تجنب التضخيم غير محدد أن ينشأ من تلوث التمهيدي-ديمر أو جدنا في3،15عينة الحمض النووي الريبي. ومن المتوقع أن مستويات الحمض النووي الريبي نسخة سوف المغالاة في إطار جدنا التلوث8. هنا، يعتبر السمات الفريدة للجينات المتاشب مقايسة تلوث جدنا في عينات الحمض النووي الريبي.
الخصائص الأساسية المتاشب المستخدمة في هذا البروتوكول: ريبوسومال الجينات تتألف من ITSs اثنين، هما ITS1 و ITS2، وثلاثة ترميز الجينات الرنا الريباسي، 17-18S، 5.8S، و 25-28 وحدة فرعية12. هاتين المنطقتين لها ليست جزءا من تسلسل ترميز ريبوسومال الوحدات الفرعية. يتم إزالتها من على الأقل ثلاثة أنشطة الانزيمية عملية تمهيدا لتنضج الرنا الريباسي: endonuclease وهيليكاز و [ااكسونوكلس] نشاط. كما يتم نسخها الرنا الريباسي كنسخة بوليسيسترونيك، منتج أساسي المتضمن في ITSs هذا التأكيد. التجهيز سريع جداً ويأخذ مكان في نوية، وكمية السلائف القابلة للاكتشاف الجزيئات المحتوية على للبحث عن أقل من حد الكشف عن الأسلوب قبكر. ولذلك، عندما ITS1 أو ITS2 تتضخم بالبحث عن المرافقة الإشعال، يمكن اكتشاف أي تضخيم في عينات الحمض النووي الريبي ما لم يوجد تلوث جدنا. قدرت عدد المتاشب الجينات في جينوم الكائنات الحية حقيقية النواة تشمل نسخ تصل إلى ألف، التي يتم ترتيبها في صفائف واحد أو متعاضدا في الكروموسومات11. ونقترح في هذا البروتوكول، طريقة بديلة، بدلاً من العلاج ببدائل النيكوتين، للكشف عن التلوث جدنا، الذي يستخدم في كل رد فعل/المقايسة.
الفوائد والقيود فيما يتعلق بالأساليب القائمة: العلاج ببدائل النيكوتين يستخدم عادة اختبار ما إذا كانت عينة الحمض النووي الريبي المعدة نظيفة أو ملوثة جدنا. حيث لا يتم توزيع التلوث جدنا موحد بين عينات الحمض النووي الريبي مختلفة، ورد فعل حساسية إلى جدنا هو تأثرا كبيرا بالجينات تم تحليلها، الضوابط النيكوتين المطلوبة لكل زوج عينة/المقايسة7،15. سيقوم هذا بإضافة التكاليف إلى حد كبير، والعمل عند التعامل مع العديد من العينات في وقت واحد3،9. وتشمل أساليب بديلة أخرى موثقة في الأدب استخدام الإشعال إنترون محددة للكشف عن جدنا، أو كبسولة تفجير تصميم الجناح إنترون أو تمتد مفرق إكسون-إكسون. القيود المفروضة على هذه الأساليب تنبع من عدم توافر معلومات تسلسل إنترون، الشروح غير مكتملة من هيكل إنترون/إكسون، ونظرا لعدم إينترونس في الجينات أو بسيودوجينيس للفائدة1،4،10 . نظراً للتطور، توجد جينات المتاشب كأسرة جين مولتيجيني ويحافظ على درجة عالية. وشديدة وفيرة في الجينوم وموجودة على الكروموسومات المختلفة13. بالمقارنة مع جينات أخرى نونكوندينج أو الترميز، تظهر الجينات المتاشب الاحتواء الأفضل للكشف عن التلوث جدنا. في التحليلات المقارنة ترانسكريبتوميك، لا ينصح تطبيع البيانات qPCR بمعايرة الرنا الريباسي لبعض القضايا، مثل الاختلافات في كدنا إعداد (فتيلة بوليا مقابل فتيلة هيكسامير عشوائي)، والاختلافات الكبيرة بين الرنا الريباسي ومرناً في وفرة ، ونشوء حيوي المختلفة التي قد تولد مضللة النتائج10،16. بيد أن المشاكل التي ذكرناها فقط ميزة لفحص التلوث جدنا. على سبيل المثال، فيما يتعلق بوفرة موقع استهداف أعلى في الجينوم والتعريب في الكروموسومات المختلفة، كبسولة تفجير المستندة إلى المتاشب إلى حد كبير تحسين حساسية الكشف عن جدنا بالمقارنة مع الأساليب القائمة.
فيرساليتي على أساس المتاشب للكائنات الحية الأخرى: المتاشب الجينات عائلة جينات مدروسة حددت في معظم الكائنات الحية. وتمثل الطريقة المقترحة على أساس المتاشب نظاما بسيطة وحساسة للغاية، والاقتصادية لفحوصات تلوث جدنا التي يمكن تكييفها بسهولة لسائر الكائنات الحية حقيقية النواة وبدائية النواة (البروتوكول 2-5). كدراسة حالة، أثبتنا هنا فائدة هذا الأسلوب في بعض الأنواع بوسي (الشكل 4 و الشكل 5). الإشعال المستخدمة تظهر نسبة عالية من قابلية للأنواع الأخرى بوسي نظراً للهيكل يحافظ على درجة عالية من مفارز المتاشب بين الأنواع. هذه المشكلة يصبح أكثر أهمية عندما لا تتوفر معلومات كافية في تسلسل الجينوم للتصميم التمهيدي. وهكذا، يمكن استخدام المرافقة للبحث عن كبسولة تفجير تصميم لأحد الأنواع في أنواع ذات صلة. أيضا، 5.8S–F/R كبسولة تفجير اعتقلوا استناداً إلى فكرة مصانة ويبين التشابه عالية في معظم النباتات المزهرة14. على الرغم من زيادة إنتاجية عالية يسلسل تقنيات بشكل دائم عدد مورثات المعروفة، لم يتم الانتهاء من الشرح إكسون-إنترون لمعظم الكائنات الحية، وحتى أنها غالباً ما تكون غير ممكنة لتصميم كبسولة تفجير تمتد إلى حدود إكسون-إكسون. لدينا أسلوب يشرح كيف المستندة إلى المتاشب الإشعال يمكن تطبيقها لفحص التلوث جدنا في تحليل qPCR لبدائيات النوى وحقيقيات النوى بهدف القضاء على الضوابط النيكوتين مكلفة في كل تركيبة الإنزيم/التمهيدي.
The authors have nothing to disclose.
بتأييد هذه البحوث الوراثية و “معهد التكنولوجيا الحيوية تاباريستان الزراعية” (جابيت) و “ساري العلوم الزراعية” والموارد الطبيعية جامعة (القوابل). ومولت المجموعة البحثية جونيور “اللاأحيائية الإجهاد الجينوم” إيزن (مركز متعدد التخصصات لبحوث المحاصيل النباتية، هالي (Saale)، وألمانيا. ونحن نشكر ماير روندا لقراءة نقدية من المخطوطة.
Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K0221 | |
TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | K1631 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
96 well WHT/CLR | Bio-Rad | HSP9601 | |
Microseal B film | Bio-Rad | MJ-0558 | |
Low tube strip CLR | Bio-Rad | TLS0801 | |
Flat cap strips | Bio-Rad | TCS0803 | |
NanoDrop 2000 | Peqlab | ND-2000 | |
RNaseZAP | Ambion | 9780 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
RNase A, DNase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0523 | |
TRIZOL Reagent | Ambion | 15596026 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BIO RAD | 1855195 | |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Guanidine thiocyanate for molecular biology | Sigma-Aldrich | G9277 | |
Agarose – Nucleic Acid Electrophoresis | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Boric Acid for molecular biology | AppliChem | A2940 | |
bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
ethidium bromide | AppliChem | A1151 | |
Gel documentation system | BIO RAD | Gel Doc 2000 |