Her presenterer vi en protokoll for sporing genomisk DNA (gDNA) forurensning i RNA prøver. Presentert metoden benytter primere bestemt intern transkribert spacer regionen (ITS) ribosomal DNA (rDNA) gener. Metoden er egnet for pålitelig og følsom oppdagelsen av DNA forurensning i de fleste eukaryoter og prokaryoter.
En metode mye brukt for kvantifisering av gene expression endringer og transkripsjon krillens er omvendt-transkripsjon kvantitative sanntid PCR (RT-qPCR). Det gir nøyaktig, sensitive, pålitelige og reproduserbar resultater. Flere faktorer kan påvirke sensitivitet og spesifisitet av RT-qPCR. Gjenværende genomisk DNA (gDNA) forurensende RNA prøver er en av dem. Gene expression analyse, uspesifisert forsterkning på grunn av gDNA forurensning vil overvurdere overflod av transkripsjon nivåer og RT-qPCR resultatet. Generelt gDNA er oppdaget av qRT PCR bruker primer par annealing intergenisk regioner eller en intron av genet av interesse. Dessverre er intron/ekson merknader ennå ikke kjent for alle gener fra virveldyr, bakterier, protist, sopp, plante og metazoan vannrenseanlegg.
Her presenterer vi en protokoll for oppdagelse av gDNA forurensning i RNA prøver ved hjelp av ribosomal DNA (rDNA)-basert primere. Metoden er basert på de unike funksjonene til rDNA: deres multigene natur, høyt konservert sekvenser og høy frekvens i genomet. Også som en case study, et unikt sett av primere ble designet basert på bevarte regionen ribosomal DNA (rDNA) i Poaceae familien. Universalitet av disse primer ble testet smelte curve analyse og agarose gel geleelektroforese. Selv om vår metode forklarer hvordan rDNA-baserte primere kan brukes for gDNA forurensning analysen i Poaceae familien, det kan lett brukes til andre ifølge og eukaryoter arter
Utforske transcriptional regulering av interessante genet sett eller signalering nettverk er viktig å forstå komplekse molekylære mekanismer involvert i biologiske events1. QPCR analyse er foreløpig mest brukte tilnærming for gene expression studier som kan målrette DNA (genomet) eller RNA (transcriptome) som methylome og transcriptome analyse, henholdsvis. Omvendt transkripsjon (RT) etterfulgt av qPCR er mye brukt for transcriptome analyse som måler gene expression nivåer i ulike områder av biologiske2. Sammenlignet med andre metoder som tradisjonelt Nord hybridization, vev spesifikke gjenkjennings via i situ hybridisering, ribonuclease beskyttelse analyser (RPA) og semi-RT-PCR, nøyaktigheten, komfort, hastighet og bredt dynamisk område av qPCR-baserte analyser er svært bemerkelsesverdig3,4. Det er flere viktige faktorer som må vurderes for en pålitelig kvantifisering av budbringer RNA (mRNA), inkludert kvaliteten og kvantiteten av starter materiale. Videre har uspesifisert forsterkning, effektiviteten av RT-qPCR og PCR effektivitet vurderes5,6.
GDNA er en iboende problem under RNA utvinning skyldes, delvis til lignende fysiske og kjemiske egenskaper av DNA og RNA7. På grunn av sekvens identiteten til gDNA og komplementære DNA (cDNA) fra mRNA prøvene, kan ikke-spesifikk forsterkning oppstå, som vil påvirke nøyaktigheten av RT-qPCR resultater. Den gjenværende gDNA vil føre til overvurdering av overflod av målrette mRNA i gene expression analyse8.
I utgangspunktet, ikke-spesifikk amplicon mest oppstår fra primer-dimer formasjon eller uspesifikke bakgrunn forsterkning på grunn av gDNA, begge kan bli vurdert av aktuelle kontrollen utvalg. Slike eksempler er ingen mal kontroll (NTC) og ingen revers transkriptase kontroll (NRT), henholdsvis. Siden gDNA forurensning i prøvene blir studert er forskjellige og sensitivitet overfor gDNA varierer sterkt mellom genene analysert, er NRT kontrollene nødvendig for hvert utvalg/analysen par. Selv om dette øker vesentlig kostnader og arbeid RT-qPCR profilering studier, er disse kontrollene nødvendig7,9.
Alternative metoder håndtere gDNA forurensning omfatter bruk av primer annealing intergenisk regioner eller en intron genet av interesse10og bruk av primer som flanke en stor intron eller span en ekson-ekson junction, dvs. webområdene annealing er fraværende i de eldre mRNA sekvens1,4. Imidlertid er intron/ekson merknader for alle gener fra mange virveldyr, bakterier, protist, sopp, anlegg og metazoan vannrenseanlegg kjent ennå. I tillegg har mange eukaryote organismer pseudogenes avledet fra duplisering hendelser. Videre garanterer ikke primer design over introns ikke-forsterkning av gDNA. Som chromatin tilgjengelighet av genomisk regionene DNase jeg varierer, er det anbefalt å utforme forskjellige primer par målretting ulike kromosomene10.
Genomer eukaryote organismer kan omfatte opptil tusen kopier av rDNA gener koding ribosomal underenheter nødvendig for ribosomer formasjon. Disse rDNA gener organiseres ofte i enkle eller tandem gjenta matriser11. Polycistronic rRNAs (figur 1) inkludert store delenhet (LSU) og små delenhet (Hei) er transkribert av RNA polymerase jeg (RNA pol jeg). De resulterende pre-rRNAs behandles videre ved å fjerne de to interne transkribere spacer regionene ITS1 og ITS2. Som siste produkter, tre eldre rRNAs, 17-18S rRNA (Hei), 5.8S og 25-28S rRNA (LSU) er generert12. rDNA gener er typiske representanter for en multigene familie med høyt konservert sekvenser. De oppstår ofte i genomet og finnes potensielt flere chromosomal sted13. Behandlingen av rRNA og nedbrytning av transkribert avstandsstykkene er en rask prosess i kjerne. På grunn av den høye graden av ballen, er forholdet mellom antall genomisk kopier og synlig ubehandlet RNA premolecules lavere i forhold til lav-kopi intron sekvenser og unspliced prekursorer. Disse funksjonene gjør rDNA gener velegnet for pålitelig og svært følsom påvisning av gDNA forurensning i de fleste prokaryoter og eukaryoter3.
Her er en ny prosedyre for å oppdage gDNA forurensning i RNA prøver beskrevet. Et sett med universell primere basert på rDNA bevart rekkefølgen er presentert for gDNA analyser i flere Poaceae arter. Spesifisitet og universalitet foreslåtte primerne ble testet av smelte curve analyse ved hjelp av DNA som en mal. Våre protokollen gjelder ikke bare for Poaceae, men kan også lett tilpasses andre eukaryote og prokaryote arter.
Gene expression analyse av kvantitative PCR har vært mye brukt de siste årene. Den viktigste fordelen med denne rask, kostnadseffektiv og automatisert metoden er presis og nøyaktig resultatet. Få optimale ytelser fra disse fordelene krever imidlertid en klar forståelse av oppsettet av parameterne som brukes for qPCR eksperimentet. For å få et pålitelig resultat i qPCR gene expression analyse, er det nødvendig å unngå uspesifikke forsterkning som oppstår fra primer-dimer eller gDNA forurensning i RNA eksempel3,15. Det forventes at RNA transkripsjon nivåene vil bli overvurdert under gDNA forurensning8. Her, de unike funksjonene til en rDNA genet ble ansett for en gDNA forurensning analysen i RNA prøver.
Grunnleggende egenskaper for rDNA brukes i denne protokollen: Ribosomal gener består av to ITSs, nemlig ITS1 og ITS2, og tre rRNA koding genene, 17-18 år, 5.8S og 25-28S delenhet12. De to ITS regionene er ikke del av koding sekvensen av ribosomal underenheter. De fjernes av minst tre enzymatisk aktivitet behandle forløperen å modne rRNA: en endonuclease, helicase og exonuclease aktivitet. Som ribosomal RNA er transkribert som polycistronic avskrift, er en primær produkt som inneholder ITSs absolutt tilstede. Behandling er veldig rask og foregår i kjerne, og mengden av synlig forløper molekyler som inneholder ITS er under gjenkjenning grensen av metoden qPCR. Derfor når ITS1 eller ITS2 er forsterket med ITS flankert primere, kan ingen forsterkning oppdages i RNA prøver med mindre gDNA forurensning er tilstede. Antall rDNA gener i genomet av eukaryote organismer ble anslått for å inkludere opptil tusen eksemplarer, som er ordnet i enkle eller tandem matriser kromosomene11. I denne protokollen foreslå vi en alternativ måte, i stedet for NRT, å oppdage gDNA forurensning, som brukes i hver reaksjon/analysen.
Fordeler og begrensninger med hensyn til eksisterende metoder: NRT brukes vanligvis til å teste om forberedt RNA prøven er ren og forurenset av gDNA. Siden gDNA forurensning ikke er fordelt jevnt mellom forskjellige RNA prøvene, og reaksjonen følsomheten til gDNA er betydelig påvirket av gener analysert, er NRT kontroller nødvendig for hver prøve/analysen par7,15. Legges vesentlig kostnader og arbeid ved håndtering av mange eksempler samtidig3,9. Andre alternative metoder i litteraturen inkluderer bruk av intron bestemt primere for påvisning av gDNA, eller designe primere som flanke en intron eller dekker et ekson-ekson kryss. Begrensningene for disse metodene stammer fra utilgjengelighet av intron oppstartsrekkefølgen, ufullstendig merknad intron/ekson struktur og fravær av introns i gener eller pseudogenes av interesse1,4,10 . På grunn av evolusjon finnes rDNA gener som multigene og høyt konservert genet familier. De er svært rikt i genomet og på ulike kromosomene13. Sammenlignet med andre koding eller nonconding gener, viser rDNA gener beste tilpassing for gjenkjenning av gDNA forurensning. I sammenlignende transcriptomic analyser, normalisering av qPCR data ved rRNA kalibrator anbefales ikke noen problemer, for eksempel forskjeller i cDNA forberedelse (polyA grunning vs tilfeldig praktiske grunning), store forskjeller i overflod mellom rRNA og mRNA , og ulike biogenesis som kan generere villedende resultater10,16. Problemene vi har nevnt er imidlertid en fordel for gDNA forurensning analysen. For eksempel med hensyn til høyere målretting stedet overflod i genom og lokalisering på ulike kromosomer forbedre rDNA-baserte primere betydelig gjenkjenning følsomheten til gDNA i forhold til eksisterende metoder.
Versality av rDNA-baserte for andre organismen: rDNA gener er en godt studert genet familie identifisert i de fleste organismer. Den foreslåtte rDNA-baserte metoden representerer et enkelt, svært følsom og økonomisk system for gDNA forurensning analyser som kan lett tilpasses andre eukaryote og prokaryote organismer (Protocol 2 – 5). Som en case study, har vi vist her nytten av denne metoden i noen Poceae arter (Figur 4 og figur 5). Brukte primerne viser en høy grad av overførbarhet til andre Poceae art på grunn av høyt konservert strukturen i rDNA underenheter blant arter. Dette problemet blir enda viktigere når tilstrekkelig genomisk oppstartsrekkefølgen ikke er tilgjengelig for primer design. Således, ITS-flankert primere designet for en art kan brukes i en beslektede arter. Også 5.8S-F/R primere ble plukket basert på en bevart motiv som viser høy likheten i de fleste planter14. Selv om høy gjennomstrømning sekvensering teknikker permanent øke antall kjente genomer, ekson-intron merknaden mest organismer er ikke fullført, og så det er ofte ikke mulig utforme primere å strekke seg over en ekson-ekson kantlinje. Vår metode forklarer hvordan rDNA-baserte primere gjeldt for gDNA forurensning analysen i qPCR analyse av prokaryoter og eukaryoter med mål om å eliminere kostbare NRT kontroller i hver analysen/primer kombinasjon.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av genetiske og landbruket bioteknologi Institute av Tabarestan (GABIT), Sari landbruksvitenskap og naturressurser University (SANRU). Junior forskningsgruppen abiotiske Stress Genomics ble finansiert av IZN (tverrfaglig senter for beskjære planteforskning, Halle (Saale), Tyskland. Vi takker Rhonda Meyer for kritisk lesning av manuskriptet.
Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K0221 | |
TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | K1631 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
96 well WHT/CLR | Bio-Rad | HSP9601 | |
Microseal B film | Bio-Rad | MJ-0558 | |
Low tube strip CLR | Bio-Rad | TLS0801 | |
Flat cap strips | Bio-Rad | TCS0803 | |
NanoDrop 2000 | Peqlab | ND-2000 | |
RNaseZAP | Ambion | 9780 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
RNase A, DNase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0523 | |
TRIZOL Reagent | Ambion | 15596026 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BIO RAD | 1855195 | |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Guanidine thiocyanate for molecular biology | Sigma-Aldrich | G9277 | |
Agarose – Nucleic Acid Electrophoresis | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Boric Acid for molecular biology | AppliChem | A2940 | |
bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
ethidium bromide | AppliChem | A1151 | |
Gel documentation system | BIO RAD | Gel Doc 2000 |