Aqui, apresentamos um protocolo para rastreamento genômica contaminação de DNA (gDNA) em amostras de RNA. O método apresentado utiliza primers específicos para a região de espaçador transcrito interno (ITS) de genes ribossomais de DNA (rDNA). O método é adequado para detecção fiável e sensível de contaminação de DNA na maioria dos eucariontes e procariontes.
Um método amplamente utilizado para a quantificação das alterações de expressão de gene e abundâncias de transcrição é reverso-transcrição do PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). Fornece resultados precisos, sensíveis, confiáveis e reprodutíveis. Vários fatores podem afetar a sensibilidade e especificidade do RT-qPCR. DNA genômico residual (gDNA) contaminar amostras do RNA é um deles. Na análise da expressão de gene, amplificação não-específica, devido à contaminação de gDNA vai superestimar a abundância de níveis de transcrição e pode afetar os resultados de RT-qPCR. Geralmente, gDNA é detectado por qRT-PCR usar primer pares recozimento para regiões intergênicas ou um intrão do gene de interesse. Infelizmente, as anotações de intron/exon ainda não são conhecidas por todos os genes do vertebrado, bactérias, Protista, fungos, plantas e espécies de invertebrados metazoários.
Aqui nós apresentamos um protocolo para a deteção de gDNA contaminação no ARN amostras usando o ADN ribossómico (rDNA)-com base em cartilhas. O método baseia-se as características únicas do rDNA: sua natureza multigene, sequências altamente conservadas e alta frequência no genoma. Também como um estudo de caso, um conjunto exclusivo de primers foram projetados com base na região conservada de ADN ribossómico (rDNA) pertencente à família Poaceae. A universalidade desses pares da primeira demão foi testada pelo derretimento curva análise e agarose electroforese do gel. Embora nosso método explica como as primeiras demão rDNA-based podem ser aplicadas para o ensaio de contaminação gDNA pertencente à família Poaceae, poderia ser facilmente usado para outras espécies de procarionte e Eukaryota
Explorar o Regulamento transcriptional de interessante moda gene ou redes de sinalização é essencial para compreender os mecanismos moleculares complexos envolvidas em eventos biológicos1. Atualmente, a análise de qPCR é o mais amplamente utilizado abordagem para gene expressão estudos que podem direcionar o DNA (genoma) ou RNA (a transcriptoma) que permitem a análise methylome e transcriptoma, respectivamente. Transcrição reversa (RT), seguida por qPCR é amplamente utilizada para a análise do transcriptoma que medem os níveis de expressão de gene em várias áreas de pesquisa biológica2. Em comparação com outros métodos como a hibridação Northern tradicional, deteção específicas de tecido via in situ da hibridação, ensaios da proteção ribonuclease (RPA) e semi-RT-PCR, a precisão, conveniência, velocidade e ampla faixa dinâmica de ensaios baseados em qPCR são altamente notável3,4. Há vários fatores importantes que devem ser considerados para uma quantificação confiável de RNA mensageiro (mRNA), incluindo a qualidade e a quantidade de RNA a partir de material. Além disso, amplificação não-específica, a eficiência de RT-qPCR e eficiência da PCR tem que ser considerado5,6.
A presença de gDNA é um problema inerente durante a extração do RNA devido, em parte, as propriedades físicas e químicas similares de DNA e RNA7. Por causa da identidade de sequência dos gDNA e DNA complementar (cDNA) derivado das amostras de mRNA, amplificação não-específica pode ocorrer, que irão influenciar a precisão dos resultados de RT-qPCR. O restante gDNA levará a superestimação da abundância de mRNA alvo de análise de expressão de gene8.
Basicamente, o amplicon inespecíficas principalmente surge da formação da primeira demão-dímero ou amplificação de fundo inespecíficos devido gDNA, ambos os quais podem ser avaliados usando amostras de controlo apropriadas. Tais amostras são nenhum controle modelo (NTC) e nenhum controle de transcriptase reversa (NRT), respectivamente. Desde que os níveis de contaminação gDNA nas amostras estudadas são diferentes e a sensibilidade em direção gDNA difere grandemente entre os genes analisados, os controles NRT são necessários para cada par de amostra/ensaio. Embora isto aumenta substancialmente o custo e o trabalho em estudos de perfil de RT-qPCR, esses controles são necessários7,9.
Métodos alternativos de lidar com a contaminação gDNA incluem o uso de pares da primeira demão, recozimento para regiões intergênicas ou um intrão do gene de interesse10e o uso de primers que flanqueiam um intrão grande ou abrangem uma junção exon-exon, ou seja os recozimento sites estão ausentes no mRNA maduro sequência1,4. No entanto, as anotações de intron/exon para todos os genes de muitos vertebrado, bactérias, Protista, fungos, plantas e espécies de invertebrados metazoários são conhecidas ainda. Além disso, muitos organismos eucariotas têm os pseudogenes derivados de eventos de duplicação. Além disso, o projeto da primeira demão do outro lado os intrões não garante não-amplificação de gDNA. Como a cromatina acessibilidade das regiões genômicas para DNase que varia, é recomendável desenhar pares diferentes cartilha visando diferentes cromossomos10.
Os genomas de organismos eucariotas podem abranger até mil cópias de genes rDNA codificação subunidades ribossomais necessárias para formação de ribossomas. Estes genes rDNA organizam-se frequentemente em matrizes simples ou em tandem repetição11. Policistrônico rRNAs (Figura 1), incluindo a grande subunidade (LSU) e uma pequena subunidade (SSU) são trascritos pela RNA polimerase eu (pol RNA eu). Os pre-rRNAs resultantes são tratados posteriormente, eliminando as duas regiões de espaçador transcrito interno ITS1 e ITS2. Como produtos finais, três maduras rRNAs, 17-18S rRNA (SSU), 5.8S e 25-28S rRNA (LSU) são gerados12. rDNA genes são típicos representantes de uma família multigene com sequências altamente conservadas. Eles ocorrem com frequência no genoma e estão potencialmente presentes em mais de um local cromossômico13. O processamento do rRNA e a degradação dos espaçadores transcritos são um processo rápido no nucléolo. Devido ao alto grau de repetitividade, a proporção do número de cópia genômica e premolecules de RNA detectáveis no seu estado inalterado é baixa em comparação com as sequências de baixo-cópia intrão e precursores unspliced. Estas características fazem do rDNA genes bem adequados para detecção confiável e altamente sensível de contaminação gDNA na maioria dos eucariontes e procariontes3.
Aqui um novel procedimento para detecção de contaminação gDNA em amostras do RNA é descrito. Um conjunto de primers universais com base na sequência de rDNA conservada é apresentado para gDNA ensaios em diversas espécies de Poaceae. A especificidade e a universalidade dos primers propostos foram testados usando o DNA como um modelo de análise da curva de derreter. Nosso protocolo não só é aplicável para Poaceae, mas pode também facilmente ser adaptado para outras espécies procariotas e eucariotas.
Análise de expressão genética por PCR quantitativo tem sido amplamente aplicada nos últimos anos. A principal vantagem deste método rápido, econômico e automatizado é seu resultado preciso e exato. No entanto, obter benefícios ideais destas vantagens exige uma compreensão clara da configuração dos parâmetros utilizados para o experimento de qPCR. Para receber um resultado confiável em análise de expressão de gene qPCR, é necessário evitar a amplificação inespecífica que surge a partir da primeira demão-dímero ou gDNA contaminação da amostra de RNA3,15. Espera-se que os níveis de transcrição do RNA vão ser sobrestimados sob gDNA contaminação8. Aqui, as características únicas de um gene de rDNA foi considerado para um ensaio de contaminação gDNA em amostras de RNA.
As propriedades básicas do rDNA utilizados neste protocolo: Ribosomal genes consistem o dois ITSs, ITS1 e ITS2 e os três genes rRNA codificação, 17-18, 5.8S e 25-28S subunidade12. As duas regiões ITS não são parte da sequência de codificação das subunidades ribossomais. Eles são removidos pelo menos três actividades enzimáticas para processar o precursor para amadurecer rRNA: uma atividade endonuclease, helicase e do exonuclease. Como o RNA ribossomal é transcrito como um transcrito policistrônico, um produto primário contendo o STI está certamente presente. O processamento é muito rápido e tem lugar no nucléolo, e a quantidade de moléculas detectáveis precursor contendo o ITS está abaixo do limite de detecção do método qPCR. Portanto, quando ITS1 ou ITS2 são amplificados pelo seu flanqueando as primeiras demão, sem amplificação pode ser detectada em amostras de RNA a menos gDNA contaminação está presente. O número de rDNA genes no genoma de organismos eucariotas, estimava-se incluir até um mil cópias, que estão dispostas em matrizes simples ou em tandem no cromossomos11. Neste protocolo, propomos uma maneira alternativa, em vez de NRT, para detectar a contaminação gDNA, que é usada em cada reação/ensaio.
Benefícios e limitações no que diz respeito a métodos existentes: NRT é normalmente usado para testar se a amostra preparada do RNA é limpa ou contaminada por gDNA. Desde gDNA contaminação não é distribuída uniformemente entre diferentes amostras de RNA, e a sensibilidade de reação para gDNA é significativamente afetada pelos genes analisados, NRT controles são necessários para cada par de amostra/ensaio7,15. Isso adicionará substancialmente o custo e trabalho ao manusear muitas amostras simultaneamente3,9. Outros métodos alternativos, documentados na literatura incluem o uso de primers específicos de intron para a detecção de gDNA, ou projetar primers que flanqueiam um intrão ou abrangem uma junção exon-exon. As limitações destes métodos decorrem a indisponibilidade de informações de sequência intrão anotação incompleta da estrutura intron/exon e a ausência de intrões de genes ou pseudogenes de interesse1,4,10 . Devido à evolução, genes rDNA existirem como famílias multigene e altamente conservada do gene. Eles são muito abundantes no genoma e presente em diferentes cromossomos13. Em comparação com outros genes codificação ou nonconding, os genes rDNA mostram o melhor ajuste para a deteção de contaminação gDNA. Em análises comparativas de transcriptomic, a normalização dos dados qPCR pelo calibrador rRNA não é recomendada para algumas questões, tais como diferenças no cDNA preparação (polyA escorva vs escorva hexâmero aleatório), grandes diferenças em abundância entre rRNA e mRNA , e biogênese diferente que pode gerar enganosa resulta10,16. No entanto, os problemas que só mencionamos são uma vantagem para o ensaio de contaminação gDNA. Por exemplo, no que diz respeito a maior abundância local alvo no genoma e localização em diferentes cromossomas, as primeiras demão rDNA-based melhorar significativamente a sensibilidade de detecção de gDNA em comparação com os métodos existentes.
Versatilidade de rDNA-based para outro organismo: rDNA genes são uma família bem estudado gene identificada na maioria dos organismos. O método proposto baseia rDNA representa um sistema simples, altamente sensível e econômico para os ensaios de contaminação gDNA que pode ser facilmente adaptado para outros organismos procariotas e eucariotas (protocolo 2 – 5). Como um estudo de caso, demonstramos aqui a utilidade desse método em algumas espécies de Poceae (Figura 4 e Figura 5). Os primers utilizados mostram uma alta taxa de transferência para outras espécies de Poceae, devido à estrutura altamente conservada de rDNA subunidades entre espécies. Esta questão se torna ainda mais importante quando informações suficientes de sequência genômica não estão disponíveis para o projeto da primeira demão. Assim, as primeiras demão ITS-flanqueando projetadas para uma espécie podem ser usadas em uma espécie relacionada. Além disso, o 5.8S-primeiras demão de F/R foram escolhidas com base em um motivo conservado que mostra alta similaridade na maioria das plantas floríferas14. Embora técnicas de sequenciamento de alto throughput permanentemente aumentam o número de genomas conhecidos, a anotação de intron-exon da maioria dos organismos não é concluída, e assim muitas vezes não é possível projetar primers para abranger uma fronteira exon-exon. Nosso método explica rDNA-baseado como primeiras demão pode ser aplicada para o ensaio de contaminação gDNA na análise de qPCR de procariotas e eucariotas com o objetivo de eliminar os controles NRT caros em cada combinação de ensaio/primer.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada pela genética e agrícola Instituto de biotecnologia de Mazandaran (GABIT), Ciências Agrárias Sari e Universidade de recursos naturais (SANRU). O grupo de Júnior pesquisa genômica de estresse abiótico foi financiado por IZN (Centro Interdisciplinar de pesquisa de planta de colheita, Halle (Saale), Alemanha. Agradecemos a Rhonda Meyer pela leitura crítica do manuscrito.
Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K0221 | |
TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | K1631 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
96 well WHT/CLR | Bio-Rad | HSP9601 | |
Microseal B film | Bio-Rad | MJ-0558 | |
Low tube strip CLR | Bio-Rad | TLS0801 | |
Flat cap strips | Bio-Rad | TCS0803 | |
NanoDrop 2000 | Peqlab | ND-2000 | |
RNaseZAP | Ambion | 9780 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
RNase A, DNase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0523 | |
TRIZOL Reagent | Ambion | 15596026 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BIO RAD | 1855195 | |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Guanidine thiocyanate for molecular biology | Sigma-Aldrich | G9277 | |
Agarose – Nucleic Acid Electrophoresis | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Boric Acid for molecular biology | AppliChem | A2940 | |
bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
ethidium bromide | AppliChem | A1151 | |
Gel documentation system | BIO RAD | Gel Doc 2000 |