Aquí, presentamos un protocolo de rastreo genómica contaminación del ADN (gDNA) en las muestras de RNA. El método presentado utiliza cebadores específicos para la región del espaciador transcrito interno (ITS) de genes ribosómicos (rDNA) del ADN. El método es adecuado para la detección fiable y sensible de la contaminación del ADN en la mayoría de eucariotas y procariotas.
Un método ampliamente utilizado para la cuantificación de cambios de expresión génica y abundancia de la transcripción es la PCR en tiempo real cuantitativa de la reverso-transcripción (RT-qPCR). Proporciona resultados precisos, sensibles, fiables y reproducibles. Varios factores pueden afectar la sensibilidad y especificidad del RT-qPCR. Residual de ADN genómico (gDNA) contaminación de las muestras de RNA es uno de ellos. En el análisis de expresión génica, amplificación no específica debido a la contaminación del gDNA sobrestiman la abundancia de niveles de transcripción y puede afectar los resultados de la RT-qPCR. Por lo general, se detecta gDNA por qRT-PCR usando la cartilla pares hibridarlo con regiones intergénicas o un intrón del gen de interés. Por desgracia, las anotaciones del intrón/del exón aún no se conocen para todos los genes de vertebrados, bacterias, Protista, hongos, plantas y especies de metazoarios invertebrados.
Aquí presentamos un protocolo para la detección de contaminación gDNA en RNA de muestras mediante el uso de ADN ribosomal (ADNr)-imprimadores base. El método se basa en las características únicas del rDNA: su naturaleza multigénica, secuencias altamente conservadas y alta frecuencia en el genoma. También como caso de estudio, un conjunto único de cartillas fueron diseñados basándose en la región conservada de ADN ribosomal (ADNr) de la familia Poaceae. La universalidad de estos pares de cartilla fue probada por electroforesis en gel análisis y agarosa curva de fusión. Aunque nuestro método explica cómo primers basados en rADN pueden ser aplicados para el ensayo de contaminación gDNA en la familia Poaceae, podría utilizarse fácilmente para otras especies de célula procariota y eucariotas
Explorando la regulación transcripcional de los interesantes conjuntos de genes o redes de señalización es fundamental para comprender los complejos mecanismos moleculares implicados en acontecimientos biológicos1. En la actualidad, análisis de qPCR es el más ampliamente utilizado enfoque para estudios de expresión génica que pueden dirigirse a ADN (el genoma) o RNA (transcriptoma) que permiten análisis metiloma y transcriptoma, respectivamente. Transcripción reversa (RT) seguida por qPCR es ampliamente utilizada para el análisis del transcriptoma que miden los niveles de expresión de genes en diversas áreas de investigación biológica2. En comparación con otros métodos como el hibridación norteño tradicional, detección específica de tejido mediante in situ hibridación, ensayos de protección de la ribonucleasa (RPA) y semi-RT-PCR, la exactitud, conveniencia, velocidad y alcance amplio y dinámico de ensayos de qPCR son altamente notable3,4. Hay varios factores importantes que tienen que ser considerados para una cuantificación fiable de ARN mensajero (ARNm), incluyendo la calidad y la cantidad de ARN a partir de material. Además, la amplificación no específica la eficacia del RT-qPCR y eficiencia PCR tienen que ser considerados5,6.
La presencia del gDNA es un problema inherente durante la extracción de RNA debido, en parte, las propiedades físicas y químicas similares de ADN y ARN7. Debido a la identidad de la secuencia del gDNA y ADN complementario (cDNA) derivado de las muestras del mRNA, la amplificación no específica puede ocurrir, que influirá en la precisión de los resultados de la RT-qPCR. GDNA restantes dará lugar a la sobrestimación de la abundancia del mRNA de destino en gene expresión análisis8.
Básicamente, los productos no específicos surge sobre todo de formación de dímeros de primer o amplificación inespecífica de fondo debido a gDNA, ambos de los cuales pueden evaluarse mediante el uso de muestras de control apropiado. Dichas muestras son ningún control de plantilla (NTC) y sin control de la transcriptasa reversa (NRT), respectivamente. Puesto que los niveles de contaminación del gDNA en las muestras estudiadas son diferentes y la sensibilidad hacia gDNA difiere mucho entre los genes analizados, los controles de la intervención NRT se requieren para cada par de muestra/ensayo. Aunque esto aumenta considerablemente el costo y el trabajo en estudios de generación de perfiles RT-qPCR, estos controles son necesarios7,9.
Métodos alternativos relacionados con la contaminación del gDNA incluyen el uso de pares de primer recocido a regiones intergénicas o un intrón del gene de interés10y el uso de cebadores que flanquean un gran intrón o abarcan a un empalme exón-exón, es decir los sitios de recocido son ausentes en el mRNA maduro secuencia1,4. Sin embargo, las anotaciones del intrón/del exón de los genes de muchos vertebrados, bacterias, Protista, hongos, planta y especies de metazoarios invertebrados se conocen todavía. Además, muchos organismos eucariotas con pseudogenes derivados de eventos de duplicación. Además, primer diseño en intrones no garantiza la no amplificación del gDNA. Como la cromatina accesibilidad de regiones genómicas a DNasa varía, se recomienda para el diseño de pares diferentes cartilla dirigida a diversos cromosomas10.
Los genomas de organismos eucariotas pueden abarcar hasta 1 mil copias de genes rDNA codifican subunidades de ribosomas necesarios para la formación de los ribosomas. Estos genes de ADNr se organizan a menudo en arreglos simples o tandem repetición11. RRNAs policistrónico (figura 1), incluyendo la subunidad grande (LSU) y la subunidad pequeña (SSU) son transcritos por la polimerasa de ARN I (pol RNA I). El pre-rRNAs resultantes se procesan aún más mediante la eliminación de las dos regiones del espaciador transcrito interno ITS1 e ITS2. Como productos finales, tres maduran rRNAs, 17-18S rRNA (SSU), 5.8S y 28S 25 rRNA (LSU) son generados12. genes del rDNA son representantes típicos de una familia multigénica con secuencias altamente conservadas. Ocurren con una alta frecuencia en el genoma y están potencialmente presentes en más de una localización cromosómica13. El procesamiento del rRNA y la degradación de los espaciadores transcritos son un proceso rápido en el nucleolo. Debido al alto grado de repetitividad, el cociente del número de copias genómicas y premolecules de RNA detectables es inferior en comparación con las secuencias del intrón de la bajo-copia y unspliced precursores. Estas características hacen que genes rDNA idóneo para la detección fiable y altamente sensible de contaminación gDNA en eucariotas y procariotas más3.
Aquí se describe un novedoso procedimiento para detectar contaminación gDNA en las muestras de RNA. Un conjunto de cebadores universales basados en la secuencia del rDNA conservado se presenta para los ensayos de gDNA en varias especies de Poaceae. La especificidad y la universalidad de los iniciadores de la propuesta se analizaron por análisis de la curva de fusión usando la DNA como plantilla. Nuestro protocolo no sólo es aplicable para la Poaceae, pero fácilmente podría adaptarse a otras especies de eucariotas y procariotas.
Análisis de expresión génica mediante PCR cuantitativa se ha aplicado extensamente en los últimos años. La principal ventaja de este método automatizado, rápido y rentable es su resultado exacto y preciso. Sin embargo, obtener beneficios óptimos de estas ventajas requiere un claro entendimiento de la configuración de los parámetros utilizados para el experimento de qPCR. Para obtener un resultado confiable en análisis de expresión génica de qPCR, es necesario para evitar la amplificación no específica que surge del primer-dimer o gDNA contaminación en la muestra de RNA3,15. Se espera que los niveles de transcripción de RNA se debe subestimarse gDNA contaminación8. Aquí, las características únicas de un gen ADNr fue considerado para un ensayo de contaminación gDNA en las muestras de RNA.
Las propiedades básicas del rDNA en este protocolo: Genes ribosómicos consisten en el dos ITSs, es decir, ITS1 y ITS2 y los tres genes de la codificación del rRNA, 17-18 años, 5.8S y 28S 25 subunidad12. Las dos regiones ITS no son parte de la secuencia de codificación de las subunidades ribosomales. Se retiran por al menos tres actividades enzimáticas para procesar el precursor madurar rRNA: una actividad endonucleasa, helicasa y exonucleasa. Como el ARN ribosómico se transcribe como una transcripción policistrónico, un producto primario que contiene las ITSs está ciertamente presente. El proceso es muy rápido y tiene lugar en el nucleolo, y la cantidad de moléculas del precursor detectable con el su es por debajo del límite de detección del método de qPCR. Por lo tanto, cuando ITS1 o ITS2 se amplifican por su acompañamiento cartillas, amplificación no puede detectarse en las muestras de RNA a menos que se presente contaminación gDNA. Se estimó el número de genes de ADNr en el genoma de los organismos eucariotas para incluir hasta 1 mil copias, que están organizadas en matrices simples o tandem en los cromosomas11. En este protocolo, se propone una forma alternativa, en lugar de NRT, detectar gDNA contaminación, que se utiliza en cada análisis de reacción.
Beneficios y limitaciones con respecto a los métodos existentes: NRT se suele utilizar para probar si la muestra de RNA preparada es limpia o contaminada por gDNA. GDNA contaminación no se distribuye uniformemente entre diferentes muestras de RNA, y la sensibilidad de la reacción a gDNA es afectada significativamente por los genes analizados, NRT controles son necesarios para cada muestra/ensayo par7,15. Esto añadirá considerablemente costos y trabajo al manipular muchas muestras simultáneamente3,9. Otros métodos alternativos, documentados en la literatura incluyen el uso de primers específicos del intrón para la detección del gDNA o diseñar cebadores que flanquean un intrón o abarcan a un empalme exón-exón. Las limitaciones de estos métodos se derivan de la falta de información de secuencia del intrón, anotación incompleto de la estructura del intrón/del exón y la ausencia de intrones en los genes o pseudogenes de interés1,4,10 . Debido a la evolución, existen genes de ADNr como familias génicas multigénica y altamente conservado. Son muy abundantes en el genoma y presentes en diferentes cromosomas13. En comparación con otros genes de codificación o nonconding, los genes de ADNr muestran el mejor ajuste para la detección de contaminación gDNA. En análisis transcriptómico comparativa, la normalización de datos qPCR por calibrador de rRNA no se recomienda para algunas cuestiones, como las diferencias en cDNA preparación (priming de polyA vs random hexamer cebado), grandes diferencias en abundancia entre rRNA y mRNA , y la biogénesis diferentes que puede generar engaño10,16. Sin embargo, los problemas que acabamos de mencionar son una ventaja para el ensayo de contaminación gDNA. Por ejemplo, con respecto a la mayor abundancia de sitio targeting en el genoma y la localización en cromosomas diferentes, cebadores basados en el rDNA mejoran significativamente la sensibilidad de detección del gDNA en comparación con los métodos existentes.
Versatilidad de rDNA a otro organismo: genes de ADNr son una familia de genes estudiados identificada en la mayoría de los organismos. El método basado en el rDNA propuesto representa un sistema simple, altamente sensible y económico para los ensayos de contaminación gDNA que puede adaptarse fácilmente a otros organismos eucarióticos y procarióticos (protocolo 2 – 5). Como caso de estudio, hemos demostrado aquí la utilidad de este método en algunas especies Poceae (figura 4 y figura 5). Los cebadores utilizados muestran una alta tasa de transferencia a otras especies Poceae debido a la estructura altamente conservada de rDNA subunidades entre especies. Este problema se vuelve aún más importante cuando suficiente información de la secuencia genómica no está disponible para el primer diseño. Por lo tanto, pueden utilizarse cebadores que flanquean su diseñados para una especie en una especie relacionada. También, el 5.8S-cartillas F/R fueron seleccionados partiendo de un motivo conservado que muestra gran similitud en la mayoría de las plantas con flores14. Aunque técnicas de secuenciación de alto rendimiento aumentan permanentemente el número de genomas conocidos, no se realiza la anotación del exón-intrón de la mayoría de los organismos, y tan a menudo no es posible diseñar primers para atravesar una frontera exón-exón. Nuestro método explica cómo base de rDNA iniciadores pueden ser aplicados para el ensayo de contaminación gDNA en análisis de qPCR de procariotas y eucariotas, con el objetivo de eliminar los costosos controles NRT en cada combinación de ensayo/primer.
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue apoyada por la genética y biotecnología agrícola Instituto de Tabarestan (GABIT), Sari ciencias agrícolas y recursos naturales Universidad (SANRU). El grupo junior de investigación genómica de estrés abiótico fue financiado por IZN (centro interdisciplinario de investigación de cultivos vegetales, Halle (Saale), Alemania. Agradecemos a Rhonda Meyer para la lectura crítica del manuscrito.
Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K0221 | |
TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | K1631 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
96 well WHT/CLR | Bio-Rad | HSP9601 | |
Microseal B film | Bio-Rad | MJ-0558 | |
Low tube strip CLR | Bio-Rad | TLS0801 | |
Flat cap strips | Bio-Rad | TCS0803 | |
NanoDrop 2000 | Peqlab | ND-2000 | |
RNaseZAP | Ambion | 9780 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
RNase A, DNase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0523 | |
TRIZOL Reagent | Ambion | 15596026 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BIO RAD | 1855195 | |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Guanidine thiocyanate for molecular biology | Sigma-Aldrich | G9277 | |
Agarose – Nucleic Acid Electrophoresis | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Boric Acid for molecular biology | AppliChem | A2940 | |
bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
ethidium bromide | AppliChem | A1151 | |
Gel documentation system | BIO RAD | Gel Doc 2000 |