Här presenterar vi ett protokoll för att spåra genomisk DNA (gDNA) kontaminering i RNA-prover. Den presenterade metoden använder tredjeparts primers som är specifika för regionen inre transkriberas spacer (ITS) ribosomal DNA (rDNA) gener. Metoden passar för tillförlitlig och känslig detektion av DNA kontaminering i de flesta Eukaryoter och prokaryoter.
En metod som i stor utsträckning används för kvantifiering av genförändringar uttryck och avskrift sammansättning är omvänd-Transkription kvantitativ realtids-PCR (RT-qPCR). Det ger korrekt, känslig, tillförlitliga och reproducerbara resultat. Flera faktorer kan påverka känsligheten och specificiteten för RT-qPCR. Kvarstående genomiskt DNA (gDNA) kontaminerande RNA prover är en av dem. I gen uttryck analys, icke-specifik amplifiering på grund av gDNA kontaminering kommer överskatta överflödet av avskrift nivåer och kan påverka RTqPCR resultatet. I allmänhet gDNA detekteras av qRT-PCR använder primer par glödgning till intergenic regioner eller en intron av genen av intresse. Tyvärr, intron/exon anteckningar är ännu inte kända för alla gener från ryggradsdjur, bakterier, protister, svampar, växter och ryggradslösa metazoan arter.
Här presenterar vi ett protokoll för detektion av gDNA kontaminering i RNA prover med hjälp av ribosomal DNA (rDNA)-baserade primers. Metoden är baserad på de unika funktionerna i rDNA: sin multigene natur, mycket sekvenser och hög frekvens i genomet. Också som en fallstudie, en unik uppsättning primers utvecklats baserat på ribosomal DNA (rDNA) i familjen Poaceae bevarade regionen. Dessa primer par universalitet testades av smälta kurva analys och agaros gelelektrofores. Även om vår metod förklarar hur rDNA-baserade primers kan tillämpas för gDNA kontaminering analysen i familjen Poaceae, det enkelt skulle kunna användas till andra prokaryoter och Eukaryoter arter
Det är viktigt att förstå de komplexa molekylära mekanismerna som är involverade i biologiska händelser1att utforska Transkriptionsreglering av intressant gen uppsättningar eller signalering nätverk. QPCR analys är för närvarande mest använda metoden för gen uttryck-studier som kan rikta antingen DNA (arvsmassan) eller RNA (transkriptom) som tillåter methylome och transkriptom analys, respektive. Omvänd Transkription (RT) följt av qPCR används ofta för transkriptom analys som mäter gen uttryck nivåer i olika områden av biologisk forskning2. Jämfört med andra metoder såsom traditionella norra hybridisering, vävnad specifika upptäckt via in situ hybridisering ribonunkleas skydd analyser (RPA) och semi-RT-PCR, riktighet, bekvämlighet, hastighet och brett dynamiskt omfång av qPCR-baserade analyser finns mycket anmärkningsvärd3,4. I området i närheten finns det flera viktiga faktorer som måste beaktas för en tillförlitlig kvantifiering av budbärar-RNA (mRNA), inklusive kvalitet och kvantitet av RNA som utgångsmaterial. Dessutom måste icke-specifik amplifiering, effektiviteten i RT-qPCR och PCR effektivitet anses5,6.
Förekomsten av gDNA var ett inneboende problem under RNA-extraktion berodde delvis liknande fysikaliska och kemiska egenskaper av DNA och RNA7. På grund av sekvens identitet gDNA och kompletterande DNA (cDNA) härrör från proverna som mRNA, kan icke-specifik amplifiering förekomma, som kommer att påverka riktigheten i RT-qPCR resultat. Den återstående gDNA kommer att leda till överskattning av överflödet av rikta mRNA i gen uttryck analys8.
I princip uppstår det icke-specifika kopian mestadels primer-dimer bildandet eller ospecifik bakgrund förstärkning på grund av gDNA, vilka båda kan bedömas med hjälp av lämpliga kontrollprover. Sådana prover är ingen mall kontroll (NTC) och ingen omvänt transkriptas kontroll (NRT), respektive. Eftersom nivåerna av gDNA kontaminering i de prover som undersöks är olika och känslighet mot gDNA skiljer sig mycket mellan de gener analyseras, krävs NRT kontrollerna för varje prov/test par. Även om detta ökar avsevärt kostnad och arbete i RT-qPCR profilering studier, är dessa kontroller nödvändiga7,9.
Alternativa metoder behandlar gDNA kontaminering inkluderar användning av primer par glödgning till intergenic regioner eller en intron genen av intresse10, och användningen av grundfärger som antingen flankerar en stor intron eller span ett exon-exon junction, dvs. glödgning platserna är frånvarande i den mogna mRNA-sekvens1,4. Dock är intron/exon anteckningar för alla gener från många ryggradsdjur, bakterier, protister, svampar, växter och ryggradslösa metazoan arter kända ännu. Dessutom har många eukaryota organismer pseudogener härrör från dubbelarbete händelser. Dessutom garanterar inte primer design över introner icke-amplifiering av gDNA. Som kromatinet tillgänglighet av genomisk regioner till DNAS jag varierar, det rekommenderas att utforma olika primer par inriktning olika kromosomer10.
Genomen hos eukaryota organismer kan omfatta upp till tusen kopior av rDNA gener som kodar ribosomal subenheter behövs för bildningen av ribosomer. Dessa rDNA gener är ofta organiserade i enkel- eller tandem upprepa matriser11. Polycistronic rRNAs (figur 1) inklusive stora subenheten (LSU) och liten subunit (SSU) transkriberas av RNA-polymeras jag (RNA pol jag). De resulterande pre-rRNAs bearbetas vidare genom att eliminera två inre transkriberas spacer regionerna ITS1 och ITS2. Som färdiga produkter, tre mogna rRNAs, 17-18S rRNA (SSU), 5.8S och 25-28S rRNA (LSU) är genererade12. rDNA gener är typiska tekniker av en multigene familj med mycket sekvenser. De uppträder med en hög frekvens i genomet och är potentiellt närvarande vid mer än en kromosomala läge13. Behandling av rRNA och nedbrytningen av transkriberas distanserna är en snabb process i nucleolus. På grund av den höga graden av upprepning, är förhållandet mellan genomisk kopienummer och påvisbara obearbetade RNA premolecules lägre jämfört med de låg-kopia intron sekvenser och Osplitsat prekursorer. Dessa funktioner gör rDNA gener väl lämpad för tillförlitlig och mycket känslig detektion av gDNA kontaminering i de flesta Eukaryoter och prokaryoter3.
Här beskrivs en roman för att upptäcka gDNA kontaminering i RNA prover. För gDNA analyser i flera Poaceae arter presenteras en uppsättning universella primers baserat på sekvensen rDNA bevarad. Den specificitet och universalitet föreslagna primers testades av smälta kurva analys med DNA som mall. Våra protokoll gäller inte bara för gräs, men kan också enkelt anpassas till andra eukaryota och prokaryota arter.
Gen uttryck analys av kvantitativ PCR har tillämpats allmänt under de senaste åren. Den största fördelen med denna snabba, kostnadseffektiva och automatiserad metod är dess precisa och korrekta resultat. Att få optimala fördelar från dessa fördelar kräver dock en tydlig förståelse för inställningen av de parametrar som används för qPCR experimentet. För att få ett tillförlitligt resultat i qPCR gen uttryck analys, är det nödvändigt att undvika ospecifik förstärkning som uppstår från primer-dimer eller gDNA kontaminering i RNA-prov3,15. Det förväntas att RNA avskrift nivåerna kommer överskattas enligt gDNA kontaminering8. Här, de unika funktionerna hos en rDNA gen ansågs för en gDNA kontaminering analys i RNA-prover.
Grundläggande egenskaper hos den rDNA som används i detta protokoll: Ribosomala generna består av de två ITSs, nämligen ITS1 och ITS2, och de tre rRNA kodning generna, 17-18 år, 5.8S, och 25-28S subenhet12. De två ITS regionerna ingår inte i den kodande sekvensen av de ribosomal subenheter. De tas bort av minst tre enzymatiska aktiviteter att bearbeta föregångaren att mogna rRNA: Amiiiiin, helicase och exonuclease verksamhet. Som ribosomalt RNA transkriberas som en polycistronic avskrift, är en primär produkt innehåller ITSs verkligen närvarande. Behandlingen är mycket snabb och tar plats i nucleolus och påvisbara föregångare molekyler som innehåller ITS uppgår under detektionsgränsen för metoden qPCR. Därför, när ITS1 eller ITS2 förstärks av ITS flankerande primers, ingen amplifiering kan upptäckas i RNA prover såvida gDNA kontaminering är närvarande. Antalet rDNA gener i genomet hos eukaryota organismer uppskattades för att inkludera upp till tusen exemplar, som är ordnade i enkel- eller tandem matriser på kromosomerna11. I detta protokoll föreslår vi ett alternativt sätt, i stället för NRT, att upptäcka gDNA kontaminering, som används i varje reaktion/analys.
Fördelar och begränsningar med avseende på befintliga metoder: NRT används vanligtvis för att testa om det beredda provet RNA är ren eller förorenade av gDNA. Eftersom gDNA kontaminering inte är jämnt fördelat mellan olika RNA-prover, och reaktion känsligheten för gDNA påverkas betydligt av de gener som analyseras, krävs NRT kontroller för varje prov/test par7,15. Detta kommer att väsentligt lägga kostnaden och arbetskraft vid hantering av många prover samtidigt3,9. Andra alternativa metoder som dokumenterats i litteraturen omfattar användning av intron specifika primers för detektion av gDNA eller designa primers som antingen flankerar en intron eller span ett exon-exon föreningspunkten. Begränsningar i dessa metoder härrör från av bristande information om intron aktivitetssekvens, ofullständig annotering av intron/exon struktur och avsaknad av introner i gener eller pseudogener intresse1,4,10 . På grund av evolution finns rDNA gener som multigene och mycket gene familjer. De är mycket rikligt i genomet och närvarande på olika kromosomer13. Jämfört med andra kodning eller nonconding gener, visar rDNA gener den bästa passformen för detektion av gDNA kontaminering. I jämförande transcriptomic analyser, normalisering av qPCR data av rRNA kalibrator rekommenderas inte för vissa frågor, såsom skillnader i cDNA förberedelse (polyA priming vs. random hexamer priming), stora skillnader i överflöd mellan rRNA och mRNA , och olika biogenes som kan generera missvisande resultat10,16. De problem som vi har nämnt är dock en fördel för gDNA kontaminering analysen. Till exempel när det gäller högre inriktning plats överflöd i genomet och lokalisering på olika kromosomer förbättra rDNA-baserade primers avsevärt upptäckt känslighet gDNA jämfört med befintliga metoder.
Versality av rDNA-baserade till andra organism: rDNA gener är en väl studerat gen familj som identifierats i de flesta organismer. Den föreslagna rDNA-baserade metoden representerar en enkel, mycket känsliga och ekonomiska system för gDNA kontaminering analyser som lätt kan anpassas till andra eukaryota och prokaryota organismer (protokoll 2 – 5). Som en fallstudie, har vi visat här nyttan av denna metod i vissa Poceae arter (figur 4 och figur 5). Använt primers visar en hög grad av överförbarhet till andra Poceae arter på grund av rDNA subenheter bland arter mycket struktur. Problemet blir ännu viktigare när tillräcklig genomiska sekvensinformation inte är tillgänglig för primer design. ITS-flankerande primers som utformats för en art kan således användas i en besläktade arter. Också, 5.8S-F/R primers plockades utifrån bevarade motiv som visar hög likheten i de flesta blommande växter14. Även om hög genomströmning sekvensering teknik öka permanent antalet kända genomen, exon-intron annotering av de flesta organismer är inte klar, och så är det ofta inte möjligt att utforma grundfärger att spänna en exon-exon gräns. Vår metod förklarar hur rDNA-baserade primers kan tillämpas för gDNA kontaminering analysen i qPCR-analys av prokaryoter och Eukaryoter med målet att eliminera dyra NRT kontroller i varje analys/primer kombination.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av genetiska och jordbruket bioteknik institutet av Tabarestan (GABIT), Sari SLU och naturresurser universitet (SANRU). Junior forskargruppen abiotisk Stress genomik finansierades av IZN (tvärvetenskapliga centrum för växtforskning gröda, Halle (Saale), Tyskland. Vi tackar Rhonda Meyer för kritisk läsning av manuskriptet.
Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K0221 | |
TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | K1631 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
96 well WHT/CLR | Bio-Rad | HSP9601 | |
Microseal B film | Bio-Rad | MJ-0558 | |
Low tube strip CLR | Bio-Rad | TLS0801 | |
Flat cap strips | Bio-Rad | TCS0803 | |
NanoDrop 2000 | Peqlab | ND-2000 | |
RNaseZAP | Ambion | 9780 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
RNase A, DNase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0523 | |
TRIZOL Reagent | Ambion | 15596026 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BIO RAD | 1855195 | |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Guanidine thiocyanate for molecular biology | Sigma-Aldrich | G9277 | |
Agarose – Nucleic Acid Electrophoresis | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Boric Acid for molecular biology | AppliChem | A2940 | |
bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
ethidium bromide | AppliChem | A1151 | |
Gel documentation system | BIO RAD | Gel Doc 2000 |