Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em> Mycobacterium tuberculosis</em
Summary
New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.
Abstract
The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.
Introduction
La tuberculosis (TB) sigue siendo una grave amenaza mundial de la salud a pesar de la disponibilidad de regímenes de quimioterapia contra la tuberculosis durante más de 40 años 1. Esto se debe en parte a la necesidad de largos períodos de tratamiento de más de 6 meses utilizando múltiples combinaciones de fármacos, lo que conduce a paciente incumplimiento 2. La aparición de la tuberculosis resistente a los medicamentos en los últimos años se ha agravado aún más los problemas en un campo en el éxito del desarrollo de fármacos clínicamente aprobados es prácticamente inexistente 3. De hecho, a pesar del desarrollo exhaustiva fármaco anti-TB, sólo un único fármaco ha sido aprobado por la FDA para uso clínico en los últimos 40 años 4. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas generaciones de fármacos antituberculosos para hacer frente a este problema.
Un problema clave en el descubrimiento de fármacos TB es la falta de éxito de la transferencia a partir de compuestos con actividad in vitro de la eficacia en el ámbito clínico= "xref"> 5, 6, 7. Inicialmente, los enfoques basados diana se utilizan para la detección de drogas anti-Mtb 5, que no se tradujo en células bacterianas enteras. Incluso cuando se utilizan células Mtb, a menudo se lleva a cabo utilizando cultivos de caldo crecido, que no predicen con precisión la eficacia del fármaco in vivo 8, 9. Estos problemas han sido reconocidos y ensayos de cribado de fármacos contra macrófagos que contienen Mtb o latente Mtb se han establecido con éxito 8, 10, 11, 12. Sin embargo, incluso estos ensayos más avanzados no dan suficiente consideración a las barreras de penetración que los medicamentos encuentran en las lesiones pulmonares no vascularizados, y en los focos necróticos en el sitio de la infección. En efecto, Incluso para la primera línea de la tuberculosis rifampicina fármaco, la dosis subóptima ha sido cuestionada debido a insuficiente en el tejido vivo y el líquido cefalorraquídeo (LCR) La penetración de 13, 14, 15, así como una disminución de la eficacia contra intracelular Mtb 8, 9. Como tal, los nuevos modelos y ensayos que tengan en cuenta estos parámetros durante el proceso de desarrollo temprana ventaja, mejoraría sin duda los esfuerzos de descubrimiento de fármacos antituberculosos.
Para hacer frente a esta necesidad, hemos establecido recientemente un modelo de bajo costo, rápida, y BSL-2 compatibles alternativa infección para las pruebas de eficacia de drogas Mtb 16. Este modelo de infección producida densamente poblado Mtb dentro de grandes estructuras de agregados de macrófagos, que recapitula las barreras de penetración celular fisiológicamente relevantes y generó macrófagos passaged <em> Mtb con un estado fisiológico alterado parecido latente Mtb. Mtb derivado de este modelo de infección se combinó con el ensayo de la resazurina de microtitulación (REMA) para evaluar la eficacia del fármaco, que produjo resultados consistentes con otros modelos de infección intracelular y se correlacionó bien con la capacidad reportada de medicamentos comunes de TB para conseguir altas concentraciones de CSF en relación con las concentraciones séricas 16.
A continuación se describe en detalle la generación de estructuras agregadas MTB / macrófagos para producir macrófagos pases Mtb adecuada para las pruebas de sensibilidad a los medicamentos utilizando REMA. En particular, se muestra cómo este sistema la infección podría ser adaptado a un formato de 96 pocillos para la compatibilidad con la detección rendimiento de los fármacos antituberculosos de candidatos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, hemos descrito en detalle un modelo de infección de Mtb alternativa adecuada para las pruebas de la eficacia del fármaco. Este modelo tiene en cuenta dos factores clave que deben ser considerados en mayor medida durante el proceso de desarrollo de la primera medicamentos contra la tuberculosis: la presencia de barreras fisiológicamente relevantes a la penetración del fármaco y cambios metabólicos de Mtb durante la infección. Si bien ya hemos demostrado los beneficios de nuestro modelo de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Frank Wolschendorf for access to the Cytation 3 automated imaging plate reader. This work was funded in part by NIH grant R01-AI104499 to OK. Parts of the work were performed in the UAB CFAR facilities and by the UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, which are funded by NIH/NIAID P30 AI027767 and by NIH 5P30 AR048311.
Materials
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/ml stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
Riferimenti
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B., et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, d. a., D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?. Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?. Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
