Invasiva comportamento delle cellule cancro al seno umano in Zebrafish embrionali
Summary
Qui, descriviamo modelli zebrafish xenotrapianto utilizzando due differenti siti di iniezione, vale a dire, lo spazio perivitellino e condotto di Cuvier, per studiare il comportamento invasivo e per valutare l'intravasation e stravaso potenziale delle cellule umane di cancro al seno, rispettivamente.
Abstract
In molti casi, i malati di cancro non muoiono di un tumore primario, ma piuttosto a causa di metastasi. Sebbene numerosi modelli di roditori sono disponibili per lo studio metastasi del cancro in vivo, sono necessari altri affidabili modelli a basso costo, efficienti, per accedere rapidamente i potenziali effetti di (epi) cambiamenti genetici o composti farmacologici. Come tale, illustriamo e spieghiamo la fattibilità di modelli di xenotrapianto usando cellule di cancro al seno umane iniettate in embrioni di zebrafish per sostenere questo obiettivo. Al microscopio, proteine fluorescenti o cellule di cancro al seno umano etichettati chimicamente vengono trapiantate in embrioni di zebrafish transgenici, Tg (fli: EGFP), presso lo spazio perivitellino o condotto di Cuvier (doc) 48 ore dopo la fecondazione. Poco dopo, il processo temporale-spaziale di invasione delle cellule del cancro, la diffusione, e le metastasi nel corpo di pesce vivente viene visualizzato sotto un microscopio a fluorescenza. I modelli utilizzano differenti siti di iniezione, cioè, perspazio ivitelline o Doc sono complementari l'uno all'altro, che riflette la fase iniziale (fase intravasation) e fase tardiva (fase stravaso) della cascata metastatica multistep di eventi. Inoltre, angiogenesi peritumorale e intratumorale può essere osservato con l'iniezione nello spazio perivitellino. L'intero periodo di sperimentazione non più di 8 giorni è. Questi due modelli combinano marcatura delle cellule, micro-trapianto, e tecniche di imaging di fluorescenza, consentendo la rapida valutazione delle metastasi del cancro in risposta a manipolazioni genetiche e farmacologiche.
Introduction
Overt metastasi del cancro in clinica comprende una serie di eventi complessi e multi-step conosciuti come "a cascata metastatica". La cascata è stato ampiamente rivisto e può essere sezionato in fasi successive: diffusione locale, intravasation, diffusione, arresto, stravaso e colonizzazione 1, 2. Una migliore comprensione della patogenesi di metastasi del cancro e lo sviluppo di possibili strategie di trattamento in vivo richiede robusti modelli di accoglienza di diffusione delle cellule del cancro. Modelli di roditori sono ben consolidata e sono ampiamente utilizzati per valutare metastasi 3, ma questi approcci hanno bassa efficienza e limitazioni etiche e sono costosi come modello prima linea per determinare se una particolare manipolazione potrebbe influenzare il fenotipo metastatico. Altri modelli di efficiente, affidabile, a basso costo sono necessari per accedere rapidamente i potenziali effetti di (epi) cambiamenti genetici o pharmacologComposti iCal. Grazie alla loro elevata omologia genetica per l'uomo e la trasparenza della loro embrioni zebrafish (Danio rerio) sono emersi come un importante modello di vertebrati e sono sempre più applicata allo studio dei processi di sviluppo, interazioni microbo-ospite, malattie umane, lo screening di stupefacenti, ecc . 4. I modelli di metastasi del cancro stabiliti in zebrafish possono fornire una risposta alle carenze di modelli di roditori 5, 6.
Anche se neoplasia spontanea è scarsamente visibile in zebrafish selvaggio 7, ci sono diverse tecniche di lunga data per indurre il cancro desiderato in zebrafish. Mutazioni geniche cancerogeni indotti o attivazione della via di segnalazione possono istologicamente e modello di carcinogenesi molecolare, imitando malattia umana in zebrafish 7, 8, 9. Con taking vantaggio di vario avanti e indietro manipolazioni genetiche di oncogeni o soppressori tumorali, (transgenico) zebrafish hanno inoltre permesso potenziali studi di formazione e manutenzione 6, 10 cancro. I modelli di cancro indotti in zebrafish coprono un ampio spettro, tra cui digestivo, riproduttivo, del sangue, del sistema nervoso, e epiteliale 6.
L'utilizzo di zebrafish nella ricerca sul cancro ha ampliato di recente a causa della creazione di modelli di xenotrapianto di cellule tumorali umane in questo organismo. Questo è stato segnalato con le cellule metastatiche di melanoma umane che sono state innestate con successo in embrioni di zebrafish allo stadio di blastula nel 2005 11. Diversi laboratori indipendenti hanno convalidato la fattibilità di questo lavoro pionieristico con l'introduzione di una gamma diversificata di linee cellulari di mammifero tumorali in zebrafish in vari siti e le fasi di sviluppo 5 </ Sup>. Ad esempio, le iniezioni vicino blastodisco e blastocisti della fase blastula; iniezioni nel sacco vitellino, spazio perivitellino, condotto di Cuvier (Doc), e posteriore cardinale vena di 6-H per 5 giorni di età embrioni; e le iniezioni nella cavità peritoneale di 30 giorni di età larve immunodepressi sono state eseguite 5, 12. Inoltre, trapianti allogenici tumorali sono stati segnalati anche in zebrafish 12, 13. Uno dei grandi vantaggi di utilizzare xenotrapianti è che le cellule tumorali trapiantate possono essere facilmente fluorescente e distinto dalle cellule normali. Quindi, indagini sulle comportamenti dinamici della formazione microtumor 14, invasione delle cellule e metastasi 15, 16, 17, l'angiogenesi indotta da tumore 15, 18, e le interazioni tra cellule tumorali e di accoglienza fattori di 17 possono essere visualizzate in modo chiaro nel corpo pesci vivi, in particolare quando le linee di zebrafish transgenici sono applicati 5.
Ispirato l'elevato potenziale di modelli xenotrapianto zebrafish valutare metastasi, abbiamo dimostrato le proprietà stravaso transvascular di differenti linee cellulari di cancro della mammella nella zona tailfin di Tg (fli: EGFP) zebrafish embrioni mediante iniezioni doc 16. Il ruolo del fattore di crescita trasformante-β (TGF-β) proteine 16 e ossa morfogenetica (BMP) 19 percorsi di segnalazione in pro- / anti-seno invasione delle cellule del cancro e le metastasi sono stati anche indagato in questo modello. Inoltre, abbiamo anche la capacità ricapitolammo intravasation di diverse linee di cellule di cancro al seno in circolazione utilizzando modelli zebrafish xenotrapianto con iniezioni di spazio perivitellino.
<p class = "jove_content"> Questo articolo presenta protocolli dettagliati per i modelli di xenotrapianto zebrafish basati su l'iniezione di cellule di cancro al seno umano nello spazio perivitellino o doc. Utilizzando l'imaging di fluorescenza ad alta risoluzione, mostriamo il processo rappresentativo di intravasation in vasi sanguigni e il comportamento invasivo di diverse cellule di carcinoma mammario umano, che si muovono dai vasi sanguigni nella zona avascolare tailfin.Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo descritto due metodi per studiare il comportamento invasivo di cellule tumorali del seno a Tg (fli1: EGFP) zebrafish embrioni, con spazio perivitellino e Doc iniezioni. Iniettando cellule tumorali marcate con colorante chimico o proteina fluorescente negli embrioni zebrafish transgenici, le caratteristiche dinamiche e spaziali di invasione e metastasi possono essere chiaramente monitorati in tempo reale alla singola cella o livello di cluster sotto un microscopio a fluorescenza. Nella maggior parte…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli studi sui familiari TGF-β sono supportati dal Cancer Genomics Centro Paesi Bassi. Sijia Liu Jiang e Ren sono supportati dal Consiglio di borse di studio in Cina per 4 anni di studio presso l'Università di Leiden. Ringraziamo il Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) per le linee di cellule MCF10A.
Materials
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
Riferimenti
- Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).
- Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).
- Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).
- Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, 62-87 (2003).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).
- He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
