ניתוח התכווצות האוטומטי של רקמת לב Engineered האנוש להקרנת בטיחות תרופת לב
Summary
כאן, אנו מציגים את הדור של רקמת לב מהונדסים אנושי מתאי גזע מושרים (hiPSC) -derived cardiomyocytes. אנו מציגים שיטה לנתח בכוח התכווצות ושינוי למופת של דפוס כיווץ ידי מעכב ערוץ hERG E-4031. שיטה זו מציגה רמה גבוהה של חוסן ויכולת התאמת הקרנת סמי לב.
Abstract
הנדסת רקמות לב מתארת טכניקות להוות שלוש רקמות מהונדסות מניב כוח ממדים. לשם יישום הנהלים אלה במחקר בסיסי ופיתוח תרופות פרה-קליני, חשוב לפתח פרוטוקולים עבור דור אוטומטי וניתוחים בתנאים סטנדרטיים. כאן, אנו מציגים טכניקה ליצירת רקמת לב Engineered (EHT) מ cardiomyocytes של מינים שונים (חולדה, עכבר, אדם). הטכניקה מתבססת על מכלול של א-ג'ל הפיברין המכיל cardiomyocytes ניתק בין polydimethylsiloxane אלסטי (PDMS) הודעות בפורמט 24-היטב. שלוש ממדי, מניב כוח EHTs מהווה בתוך שבועות אחרי הליהוק. הליך זה מאפשר לדור של כמה מאות EHTs בשבוע מוגבל מבחינה טכנית רק על ידי הזמינות של שריר הלב (0.4-1.0 x 10 6 / EHT). הערכת התכווצויות שרירי auxotonic מתבצעת בתא דגירה שונה עם mechanמשתלב iCal עבור צלחות 24-היטב ומצלמה ממוקמת על גבי תא זה. תוכנה שולטת במצלמה עבר על מערכת צירים XYZ לכל EHT. התכווצויות EHT מזוהות על ידי אלגוריתם זיהוי דמות אוטומטי, וכוח מחושב על בסיס קיצור של EHT ואת הנטייה אלסטי וגיאומטריה של הודעות PDMS. הליך זה מאפשר ניתוח אוטומטי של מספרים גבוהים של EHT בתנאים סטנדרטיים סטרילי. זיהוי האמין של שפעות תרופה על התכווצות cardiomyocyte הוא קריטי להתפתחות ופרמקולוגיה בטיחות תרופת לב. אנו מדגימים, עם הדוגמא של E-4031 מעכב ערוץ hERG, שמערכת EHT האנושית משכפלת תגובות תרופה על קינטיקה התכווצות של הלב האנושי, המציין שזה יהיה כלי מבטיח עבור הקרנת בטיחות תרופת לב.
Introduction
תופעות לוואי לב כגון תסמונת QT-induced סמים הארוכה הובילו משייכות שוק לאורך השנים האחרונות. הסטטיסטיקה מצביעה על כך כ -45% מכלל משיכות הן בשל השפעות לא רצויות על מערכת הלב וכלי הדם 1. כישלון התרופה הזו לאחר התהליך ואישור התפתחותי היקר הוא התרחיש הגרוע ביותר עבור חברות תרופות. מחלקות מחקר ופיתוח ולפיכך להתמקד זיהוי של תופעות קרדיווסקולריות רצויות כגון מוקדם. אם יש לך חששות כלכליים ואתיים, המאמצים לצמצום ניסויים בבעלי החיים ולהחליפם מבחני מיון חדשים במבחנה נמשכת.
סט של מבחנים הוקמו כלולים מנהל המזון והתרופות בארה"ב (FDA) סוכנות תרופות האירופית (EMA) הנחיות להערכת פרה-קלינית של שפעות תרופת proarrhythmic 2. הטכנולוגיה של תכנות מחדש תאים סומטיים ואחריו בידול שלתאי גזע אנושיים מושרים (hiPSC) שפרו שדה מחקר זה 3. כעת הוא מציע את האפשרות לסנן מועמדי תרופה חדשים על שריר לב אנושי במבחנה ונמנע בעיות עם הבדלים-מיני שאר. פרוטוקולי בידול לב אחרונים 4, 5 לספק היצע בלתי מוגבל של שריר לב בלי חשש אתי. עם זאת, המדידה של כוח ההתכווצות, החשוב ביותר המאופיין ביותר בפרמטר vivo של שריר לב, אינה מבוססת דיו. זה קשור הבגרות היחסית 6 של שריר לב הנגזרות תא גזע מושר האנושי (hiPSC-CM) בהשוואת cardiomyocyte המבוגר. התקדמות אפשרית היא להנדס רקמת לב 3 ממדים ממשפחות חד תאי 7 (רקמה לב מהונדס, EHT). פרוטוקול EHT מבוסס על הטבעה בעכברים יחידים או שריר לב אנושי 8 </sup>, 9, 10 ב הידרוג'ל הפיברין בין שני polydimethylsiloxane הגמיש (PDMS) הודעות 11 בפורמט 24-היטב. תוך כמה ימים cardiomyocytes להתחיל להתכווץ באופן ספונטני כמו תאים בודדים ולהתחיל להקים רשתות סלולריות. לאחר 7-10 ימים, התכווצויות מקרוסקופית של הרקמה כולה גלויות. במהלך תהליך זה מטריקס היא שופצה, אשר מובילה לירידה של קוטר ואורך. קיצור של תוצאות EHT כיפוף של PDMS לפרסם אפילו במנוחה, העמדת cardiomyocytes בתוך EHT בפיתוח עומס מתמשך. EHTs ממשיך לבצע התכווצויות שרירי auxotonic פני מספר שבועות. EHTs האדם להראות תגובות לגירויים פיסיולוגיים תרופתיים מציין התאמת הקרנה ומחלות תרופת דוגמנות 7.
בכתב היד הזה אנו מציגים פרוטוקול חזק וקל עבור generatiעל של EHT האנושית, ואת ניתוח התכווצות אוטומטית של שינויים תלויי ריכוז של דפוס כיווץ בנוכחות מעכבי ערוץ hERG.
Protocol
Representative Results
Discussion
רקמת לב מהונדסים מציעה אפשרות רבת ערך בתיבת כלי מחקר לב וכלי דם. EHTs בפורמט 24-היטב הוכיח יקר עבור מודלי מחלה 8, 14, הקרנת בטיחות תרופת 7, 8, 10, 11, 15, או למ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים אלסנדרה מורטי דניס ושאדה עבור תרומה של חומר מסוגם. אנו מכירים את התמיכה הגדולה של קבוצת עבודה שב"ס EHT במחלקה לפרמקולוגיה ניסיוני טוקסיקולוגיה של צעידה נמרצת. עבודתם של המחברים נתמך על ידי תרומות של DZHK (מרכז גרמנית למחקר קרדיו) ומשרד הגרמנית לחינוך ולמחקר (BMBF), קרן המחקר הגרמנית (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), המרכז הלאומי הבריטי עבור החלפת חידוד & הפחתת בבעלי חיים למחקר (סדק IT NC3Rs להעניק 35,911-259,146), קרן הלב הבריטית RM / 13 / 30,157, המועצה האירופית למחקר (Advanced Grant IndivuHeart), קרן הלב גרמנית ואת פרייה und Hansestadt המבורג.
Materials
| EHT analysis intrument | EHT Technologies GmbH | A0001 | Software is included |
| EHT PDMS rack | EHT Technologies GmbH | C0001 | |
| EHT PTFE spacer | EHT Technologies GmbH | C0002 | |
| EHT electrode | EHT Technologies GmbH | P0001 | |
| EHT pacing adapter/cable | EHT Technologies GmbH | P0002 | |
| 24-well-plate | Nunc | 144530 | |
| 6 well-cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| 15 ml falcon tube, graduated | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 831,830 | |
| Spinner flask | Integra | 182 101 | |
| Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct | Thermo scientific | 70101 | Adjust rotor speed to 40 rpm |
| T175 cell culture flask | Sarstedt | 831,812,002 | |
| V-shaped sedimentation rack | Custom made at UKE Hamburg | na | |
| 10× DMEM | Gibco | 52100 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma Aldrich | M6145 | |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma Aldrich | 49752 | |
| Activin-A | R&D systems | 338-AC | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-019 | |
| Aprotinin | Sigma Aldrich | A1153 | |
| Aqua ad injectabilia | Baxter GmbH | 1428 | |
| B27 PLUS insulin | Gibco | 17504-044 | |
| BMP-4 | R&D systems | 314-BP | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| DMEM | Biochrom | F0415 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
| DNase II, type V (from bovine spleen) | Sigma | D8764 | |
| Dorsomorphin | abcam | ab120843 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10437028 | |
| FGF2 | Miltenyi Biotec | 130-104-921 | |
| Fibrinogen (bovine) | Sigma Aldrich | F8630 | |
| Geltrex | Gibco | A1413302 | For coating: 1:200 dilution |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14175-053 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Horse serum | Life technologies | 26050088 | |
| Human serum albumin | Biological Industries | 05-720-1B | |
| Insulin, human | Sigma Aldrich | I9278 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-024 | |
| Lipidmix | Sigma Aldrich | L5146 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For EHT reconsitutionmix. |
| N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide | TCI | B3082-25G | |
| PBS w/o MgCl2/CaCl2 | Biochrom | 14190 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| TGFß1 | Peprotech | 100-21 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T7513 | |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T8158 | |
| Y-27632 | Biorbyt | orb6014 | |
| hiPSC | Custom made at UKE hamburg | na | |
| iCell cardiomyocytes kit | Cellular Dynamics International | CMC-100-010-001 | |
| Pluricyte cardiomyocyte kit | Pluriomics | PCK-1.5 | |
| Cor.4U – HiPSC cardiomyocytes kit | Axiogenesis AG | Ax-C-HC02-FR3 | |
| Cellartis cardiomyocytes | Takara Bio USA, Inc. | Y10075 |
Riferimenti
- Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines?. Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Burridge, P. W. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Mannhardt, I. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
- Eder, A. Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 109 (6), 436 (2014).
- Stöhr, A. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).
- Schaaf, S. Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Hansen, A. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).
- Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PloS One. 7 (7), e41958 (2012).
- Lanier, M. Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response. J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).
- Hirt, M. N. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).
- Jacob, F. Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue. PLoS One. 11 (2), e0145937 (2016).
- Friedrich, F. W. Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).
- Crocini, C. Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 108 (3), 349 (2013).
- Fiedler, J. Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization. J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).
- van Meer, B. J. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
- Eng, G. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Commun. 7, 10312 (2016).
- Huebsch, N. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).
- Masumoto, H. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).
- Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues. Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Vandenburgh, H. Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
