Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening
Summary
Hier zeigen wir die Herstellung von humanen konstruierte Herzgewebe aus induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) abgeleitetes Kardiomyozyten. Wir stellen eine Methode Kontraktionskraft und beispielhafte Veränderung der Kontraktionsmuster durch den hERG-Kanal-Hemmer E-4031 zu analysieren. Dieses Verfahren zeigt hohe Robustheit und die Eignung für das Herz Wirkstoff-Screening.
Abstract
Cardiac Tissue Engineering beschreibt Techniken dreidimensionale Krafterzeugungs engineered Gewebe zu bilden. Für die Umsetzung dieser Verfahren in der Grundlagenforschung und die präklinische Entwicklung von Medikamenten, ist es wichtig, Protokolle zur automatisierten Generierung und Analyse unter standardisierten Bedingungen zu entwickeln. Hier präsentieren wir eine Technik Engineered Herzgewebe (EHT) von Kardiomyozyten verschiedener Spezies zu erzeugen (Ratte, Maus, Mensch). Die Technik beruht auf der Anordnung eines Fibrin-Gel, das dissoziiert Kardiomyozyten zwischen elastischer Polydimethylsiloxan (PDMS) Einträgen in einem 24-Well-Format. Dreidimensionale, krafterzeugende EHTs bilden innerhalb von zwei Wochen nach dem Gießen. Dieses Verfahren ermöglicht die Erzeugung von mehreren hundert EHTs pro Woche und ist technisch nur durch die Verfügbarkeit von Kardiomyozyten (0,4-1,0 × 10 6 / EHT) begrenzt. Bewertung der auxotonisches Muskelkontraktionen in einem modifizierten Inkubationskammer mit einem mechan durchgeführtische Verriegelung für 24-Well-Platten und eine Kamera auf der Oberseite dieser Kammer angeordnet. Eine Software steuert eine Kamera auf einem XYZ-Achsensystem an jede EHT bewegt. EHT Kontraktionen werden durch eine automatisierte Figur Erkennungsalgorithmus erkannt wird, und wird eine Kraft berechnet, basierend auf Verkürzung der EHT und die elastische Neigung und die Geometrie der PDMS Beiträge. Dieses Verfahren ermöglicht die automatisierte Analyse von hohen Zahl von EHT unter standardisierten und sterilen Bedingungen. Die zuverlässige Erkennung von Arzneimittelwirkungen auf Kardiomyozyten Kontraktion ist von entscheidender Bedeutung für die Herzarzneimittelentwicklung und Sicherheitspharmakologie. Wir zeigen, mit dem Beispiel der hERG Kanalinhibitor E-4031, dass das menschliche EHT System Arzneimittelantworten auf der Kontraktion Kinetik des menschlichen Herzens nachbildet, angibt, dass es ein vielversprechendes Werkzeug für die kardialen Arzneimittelsicherheit Screening sein.
Introduction
Herznebenwirkungen wie die Arzneimittel-induzierte Long-QT-Syndrom haben Rücknahme aus dem Markt in den letzten Jahren geführt. Statistiken zeigen , dass etwa 45% aller Abhebungen fällig sind , um unerwünschte Auswirkungen auf das Herz – Kreislauf – System 1. Dieses Medikament Versagen nach dem teueren Entwicklungsprozess und die Genehmigung ist das Worst-Case-Szenario für Pharmaunternehmen. Forschungs- und Entwicklungsabteilungen konzentrieren sich daher auf dem Nachweis von solchen unerwünschten kardiovaskulären Wirkungen frühzeitig zu erkennen. Aus wirtschaftlichen und ethischen Bedenken, die Bemühungen um Tierversuche zu reduzieren und ersetzen sie durch neue di – vitro – Screening – Tests sind im Gange.
Eine Reihe von etablierten Assays sind in den Vereinigten Staaten Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittel – Agentur (EMA) Richtlinien für die präklinische Bewertung von proarrhythmischen Arzneimittelwirkungen 2 enthalten. Die Technologie von somatischen Zellen durch Differenzierung gefolgt Umprogrammierung vonmenschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) verstärkt dieses Forschungsgebiet 3. Es bietet nun die Möglichkeit , neue Medikamentenkandidaten auf dem menschlichen Kardiomyozyten in vitro zu screenen und vermeidet Probleme mit Wechselwirkungen zwischen den Arten Unterschieden. Aktuelle Herzdifferenzierungsprotokolle 4, 5 bieten unbegrenzte Versorgung von Kardiomyozyten ohne ethische Bedenken. Die Messung der Kontraktionskraft ist die wichtigste und am besten charakterisierte jedoch in vivo Parameter von Kardiomyozyten, nicht gut etabliert. Dies hängt mit der relativen Unreife 6 des menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CM) im Vergleich zu dem erwachsenen Kardiomyozyten. Eine mögliche Weiterentwicklung ist 3-dimensionale Herzgewebe aus einzelnen Zellen zu konstruieren , 7 (engineered Herzgewebe, EHT). Das EHT – Protokoll basiert auf einzelnen murinen oder humanen Kardiomyozyten Einbettung 8 </sup>, 9, 10 in Fibrinhydrogel zwischen zwei flexiblen Polydimethylsiloxan (PDMS) Pfosten 11 in 24-Well – Format. Innerhalb von wenigen Tagen beginnen die Kardiomyozyten spontan als einzelne Zellen zu kontrahieren und starten Mobilfunknetze zu bilden. Nach 7-10 Tagen sind makroskopische Kontraktionen des gesamten Gewebes sichtbar. Während dieses Prozesses wird die extrazelluläre Matrix umgestaltet, was zu einer Abnahme des Durchmessers und der Länge führt. Die Verkürzung der EHT Ergebnisse in der PDMS Biege Post auch während der Ruhe, Kardiomyozyten in der Entwicklung von EHT zu Dauerbelastung ausgesetzt wird. EHTs weiterhin auxotonisches Muskelkontraktionen über mehrere Wochen durchzuführen. Human EHTs zeigen Reaktionen auf physiologische und pharmakologische Stimulation anzeigt , deren Eignung für Wirkstoff – Screening und Krankheit 7 modellieren.
In diesem Manuskript präsentieren wir ein robustes und einfaches Protokoll für die Generatiauf der menschlichen EHT, und die automatisierten Analyse von Kontraktilität konzentrationsabhängigen Veränderungen des Kontraktionsmusters in Gegenwart von hERG Kanalinhibitoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ausgeführt Herzgewebe bieten eine wertvolle Option für den Werkzeugkasten der kardiovaskulären Forschung. EHTs in dem 24-Well – Format haben für Krankheit Modellierung 8, 14, Arzneimittelsicherheit Screening 7, 8, 10, 11, 15, oder basisches Cardiovascular Research 16,<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Alessandra Moretti und Dennis Schade für ihre Art Beitrag des Materials. Wir erkennen die große Unterstützung der iPS und EHT-Arbeitsgruppe am Institut für Experimentelle Pharmakologie und Toxikologie des UKE. Die Arbeit der Autoren wird durch Zuschüsse aus dem DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislaufforschung) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 unterstützt / 5-1 ), British National Center für das Ersatz-Refinement & Reduktion von Tieren in der Forschung (NC3Rs CRACK-IT 35.911-259.146 gewähren), die British Heart Foundation RM / 13/30157, der Europäischen Forschungsrat (Advanced Grant IndivuHeart), die deutsche Herzstiftung und die Freie und Hansestadt Hamburg.
Materials
| EHT analysis intrument | EHT Technologies GmbH | A0001 | Software is included |
| EHT PDMS rack | EHT Technologies GmbH | C0001 | |
| EHT PTFE spacer | EHT Technologies GmbH | C0002 | |
| EHT electrode | EHT Technologies GmbH | P0001 | |
| EHT pacing adapter/cable | EHT Technologies GmbH | P0002 | |
| 24-well-plate | Nunc | 144530 | |
| 6 well-cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| 15 ml falcon tube, graduated | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 831,830 | |
| Spinner flask | Integra | 182 101 | |
| Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct | Thermo scientific | 70101 | Adjust rotor speed to 40 rpm |
| T175 cell culture flask | Sarstedt | 831,812,002 | |
| V-shaped sedimentation rack | Custom made at UKE Hamburg | na | |
| 10× DMEM | Gibco | 52100 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma Aldrich | M6145 | |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma Aldrich | 49752 | |
| Activin-A | R&D systems | 338-AC | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-019 | |
| Aprotinin | Sigma Aldrich | A1153 | |
| Aqua ad injectabilia | Baxter GmbH | 1428 | |
| B27 PLUS insulin | Gibco | 17504-044 | |
| BMP-4 | R&D systems | 314-BP | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| DMEM | Biochrom | F0415 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
| DNase II, type V (from bovine spleen) | Sigma | D8764 | |
| Dorsomorphin | abcam | ab120843 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10437028 | |
| FGF2 | Miltenyi Biotec | 130-104-921 | |
| Fibrinogen (bovine) | Sigma Aldrich | F8630 | |
| Geltrex | Gibco | A1413302 | For coating: 1:200 dilution |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14175-053 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Horse serum | Life technologies | 26050088 | |
| Human serum albumin | Biological Industries | 05-720-1B | |
| Insulin, human | Sigma Aldrich | I9278 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-024 | |
| Lipidmix | Sigma Aldrich | L5146 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For EHT reconsitutionmix. |
| N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide | TCI | B3082-25G | |
| PBS w/o MgCl2/CaCl2 | Biochrom | 14190 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| TGFß1 | Peprotech | 100-21 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T7513 | |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T8158 | |
| Y-27632 | Biorbyt | orb6014 | |
| hiPSC | Custom made at UKE hamburg | na | |
| iCell cardiomyocytes kit | Cellular Dynamics International | CMC-100-010-001 | |
| Pluricyte cardiomyocyte kit | Pluriomics | PCK-1.5 | |
| Cor.4U – HiPSC cardiomyocytes kit | Axiogenesis AG | Ax-C-HC02-FR3 | |
| Cellartis cardiomyocytes | Takara Bio USA, Inc. | Y10075 |
Riferimenti
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