Purificazione di alto peso molecolare genomico da oidio per lungo-Read Sequencing

Summary

Qui descritto è un metodo per l'estrazione, la purificazione e il controllo di qualità del DNA genomico dal patogeno fungino biotrofico obbligato, l'oidio, da utilizzare nel sequenziamento del genoma a lettura lunga.

Abstract

I funghi oidio sono un gruppo di economicamente importanti patogeni delle piante fungine. Relativamente poco si sa sulla biologia molecolare e genetica di questi agenti patogeni, in parte a causa della mancanza di risorse genetiche e genomiche ben sviluppati. Questi organismi hanno grandi, genomi ripetitivi, che hanno reso il sequenziamento del genoma e l'assemblaggio proibitivo difficile. Qui, descriviamo i metodi per la valutazione raccolta, l'estrazione, la purificazione e controllo di qualità di alto peso molecolare DNA genomico da specie muffa uno polverulente, Golovinomyces cichoracearum. Il protocollo descritto comprende distruzione meccanica delle spore seguiti da un ottimizzato fenolo / cloroformio estrazione di DNA genomico. Una resa tipica era 7 ug di DNA a 150 mg conidi. Il DNA genomico che viene isolato utilizzando questa procedura è adatto per il sequenziamento lungo lettura (cioè,> 48,5 kbp). misure di controllo qualità per garantire la dimensione, la resa e la purezza del DNA genomico sono anchedescritto in questo metodo. Sequenziamento del DNA genomico della qualità descritta qui consentirà per l'assemblaggio e il confronto dei genomi multipli oidio, che a sua volta portare ad una migliore comprensione e un migliore controllo di questo patogeno agricolo.

Introduction

Mal bianco sono un gruppo di piante obbligato fungina biotrofico agenti patogeni che, nel loro insieme, sono la principale causa di malattie delle piante in tutto il mondo ^1. Ci sono oltre 900 specie descritte di oidio, che sono stati tassonomico raggruppati in cinque tribù all'interno della famiglia Erisyphaceae ^2. Sia per la loro importanza economica e l'intimo rapporto si sviluppano con i loro ospiti, malattie oidio sono stati oggetto di ricerca per> 100 anni. Al momento l'infezione, mal bianco suscitano drastici cambiamenti nella struttura cellulare, il metabolismo e la biologia molecolare....

Protocol

1. Preparazione del materiale Fungal

1. Crescere Oidio
   1. Crescere le piante in camere di crescita con le seguenti condizioni: 22 ° C Temperatura di giorno, temperatura 20 ° C notte, 80% di umidità relativa, 14-h giornata intera e un'intensità luminosa di 125 μE / m ² / s (fornito da lampade fluorescenti ).
   2. Infettare piante di cetriolo (Cucumis sativa varietà Bush Champion) con Golovinomyces cichoracearum ceppo UCSC1 come descritto ^{18, 29.}
2. Fare la raccolta Oidio Conidi
   1. Raccolto conidi da piante infette a 7 - 10 giorni dopo l....

Results

Un esempio rappresentativo di 60ng purificato DNA genomico da G. cichoracearum eseguito su un gel di agarosio usando elettroforesi su gel e utilizzando campo pulsato elettroforesi su gel sono mostrati nelle Figure 1 e 2 rispettivamente,. preparazioni di DNA genomico che passano, marginalmente accettazione e di rifiuto controllo qualità sono rappresentati. preparazioni di DNA genomico che passano completamente il controllo della .......

Discussion

Per ottenere puro, alto peso molecolare DNA genomico dal obbligato biotrofico funghi oidio, una versione modificata di metodi precedentemente descritti è stato sviluppato ^30. La resa media usando questo protocollo ottimizzato è 7 ug di DNA a 150 mg conidi, un raddoppio della resa ottenuta con un protocollo precedente. Inoltre, la dimensione media è aumentata da circa 20 a oltre 48,5 kbp kbp. Questo protocollo è stato ottimizzato nel cucumber- sistema cichoracearum G.. Per ottenere la mig.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mulino a sfere MM400	Retsch	20.745.0001	O mulino a sfere equivalente
2 mL provette per fresatura a sfere	Sarstedt	72.694.007
Sfere di fresatura in acciaio inox da 5/32"	OPS Diagnostics	GBSS 165-5000-01
Bagno d'acqua della serie 280 controllato da microprocessore Preimpostato su 65 ° C	Thermo Fisher Scientific	2825	o bagnomaria equivalente
Bagnomaria serie 280 controllato da microprocessore Preimpostato su 37 ° C	Thermo Fisher Scientific	2825	O equivalente bagnomaria
Eppendorf 5417R microcentrifuga refrigerata	Krakeler Scientific	38-022621807	O microcentrifuga equivalente
Chlorform: IAA (24:1 v/v)	Sigma-Aldrich	C0549	Pericoloso in caso di contatto con la pelle o inalazione. Indossare guanti in nitrile, occhiali protettivi, camice da laboratorio e lavorare in cappa chimica
Fenolo:Cloroformio:IAA (25:24:1 v/v)	Thermo Fisher Scientific	15593031	Pericoloso in caso di contatto con la pelle o inalazione. Indossare guanti in nitrile, occhiali protettivi, camice da laboratorio e lavorare in cappa chimica
100% isopropanolo	Sigma-Aldrich.
100% etanolo	Sigma-Aldrich	34923	Freddo a -20 ° C uso precedente
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich	S2889
Rnasi, senza DNA (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	EN0531
Metabisolfito di potassio	Sigma-Aldrich	P2522
Sodio Lauril Sacroinato	Sigma-Aldrich	L9150
Tris base	Sigma-Aldrich
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma-Aldrich	EDS
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Bromuro di cetiltrimetilammonio (CTAB)	Sigma-Aldrich	H6269
Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme	Staples	423263	O occhiali equivalenti
Guanti in nitrile High Five COBALT, LARGE	Neta Scientific	HFG-N193	O guanti equivalenti
GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10.000x in acqua	Biotium	41003
Bromuro di etidio 10 mg/mL	Biotium	40042	Pericoloso in caso di contatto con la pelle. Indossare guanti in nitrile e occhiali protettivi
Bioreagente ultrapuro di agarosio	VWR International LLC	JT4063
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific FERSM1332
8 - 48 kb CHEF Standard di dimensioni del DNA	Bio-Rad	170-3707
Pippin Prep	Life Technologies Corporation	4472172	O aparato gel equivalente per campi pulsati
Carta da filtro qualitativa Whatman, Grado 1	Sigma-Aldrich	Camera di	crescita WHA1001042 o equivalente
Camera di crescita Percival Percival AR66LXC9
Spettrofotometro UV-Vis Nano	Fisher Scientific	ND-8000-GL	O spettrofotometro equivalente
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	P11496
TAE Buffer (Tris-acetato-EDTA) (50x)	Thermo Fisher Scientific	B49	Diluire 1/50 con acqua prima dell'uso (fino a 1x)
TE Buffer	Thermo Fisher Scientific	12090015
Tris-Borato-EDTA, 10x Soluzione (Elettroforesi)	Thermo Fisher Scientific BP13334		Diluire 1/10 con acqua prima dell'uso (fino a 1x)
Azoto			Azoto liquido (-196 ° C) è un pericolo di congelamento. Inoltre, si espande rapidamente dopo il riscaldamento e non deve essere conservato in un contenitore ben chiuso