Qui descritto è un metodo per l'estrazione, la purificazione e il controllo di qualità del DNA genomico dal patogeno fungino biotrofico obbligato, l'oidio, da utilizzare nel sequenziamento del genoma a lettura lunga.
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Articolo metodologico
Purificazione di alto peso molecolare genomico da oidio per lungo-Read Sequencing
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I funghi oidio sono un gruppo di economicamente importanti patogeni delle piante fungine. Relativamente poco si sa sulla biologia molecolare e genetica di questi agenti patogeni, in parte a causa della mancanza di risorse genetiche e genomiche ben sviluppati. Questi organismi hanno grandi, genomi ripetitivi, che hanno reso il sequenziamento del genoma e l'assemblaggio proibitivo difficile. Qui, descriviamo i metodi per la valutazione raccolta, l'estrazione, la purificazione e controllo di qualità di alto peso molecolare DNA genomico da specie muffa uno polverulente, Golovinomyces cichoracearum. Il protocollo descritto comprende distruzione meccanica delle spore seguiti da un ottimizzato fenolo / cloroformio estrazione di DNA genomico. Una resa tipica era 7 ug di DNA a 150 mg conidi. Il DNA genomico che viene isolato utilizzando questa procedura è adatto per il sequenziamento lungo lettura (cioè,> 48,5 kbp). misure di controllo qualità per garantire la dimensione, la resa e la purezza del DNA genomico sono anchedescritto in questo metodo. Sequenziamento del DNA genomico della qualità descritta qui consentirà per l'assemblaggio e il confronto dei genomi multipli oidio, che a sua volta portare ad una migliore comprensione e un migliore controllo di questo patogeno agricolo.
Introduzione
Mal bianco sono un gruppo di piante obbligato fungina biotrofico agenti patogeni che, nel loro insieme, sono la principale causa di malattie delle piante in tutto il mondo 1. Ci sono oltre 900 specie descritte di oidio, che sono stati tassonomico raggruppati in cinque tribù all'interno della famiglia Erisyphaceae 2. Sia per la loro importanza economica e l'intimo rapporto si sviluppano con i loro ospiti, malattie oidio sono stati oggetto di ricerca per> 100 anni. Al momento l'infezione, mal bianco suscitano drastici cambiamenti nella struttura cellulare, il metabolismo e la biologia molecolare....
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Protocollo
1. Preparazione del materiale Fungal
- Crescere Oidio
- Crescere le piante in camere di crescita con le seguenti condizioni: 22 ° C Temperatura di giorno, temperatura 20 ° C notte, 80% di umidità relativa, 14-h giornata intera e un'intensità luminosa di 125 μE / m 2 / s (fornito da lampade fluorescenti ).
- Infettare piante di cetriolo (Cucumis sativa varietà Bush Champion) con Golovinomyces cichoracearum ceppo UCSC1 come descritto 18, 29.
- Fare la raccolta Oidio Conidi
- Raccolto conidi da piante infette a 7 - 10 giorni dopo l....
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Risultati
Un esempio rappresentativo di 60ng purificato DNA genomico da G. cichoracearum eseguito su un gel di agarosio usando elettroforesi su gel e utilizzando campo pulsato elettroforesi su gel sono mostrati nelle Figure 1 e 2 rispettivamente,. preparazioni di DNA genomico che passano, marginalmente accettazione e di rifiuto controllo qualità sono rappresentati. preparazioni di DNA genomico che passano completamente il controllo della .......
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Discussione
Per ottenere puro, alto peso molecolare DNA genomico dal obbligato biotrofico funghi oidio, una versione modificata di metodi precedentemente descritti è stato sviluppato 30. La resa media usando questo protocollo ottimizzato è 7 ug di DNA a 150 mg conidi, un raddoppio della resa ottenuta con un protocollo precedente. Inoltre, la dimensione media è aumentata da circa 20 a oltre 48,5 kbp kbp. Questo protocollo è stato ottimizzato nel cucumber- sistema cichoracearum G.. Per ottenere la mig.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo protocollo è stato sviluppato a sostegno di un progetto di sequenziamento congiunto Genome Institute-Community (#1657). Il lavoro è stato sostenuto in parte dalla Philomathia Foundation, dalla National Science Foundation (#0929226) e dall'Energy Biosciences Institute a S. Somerville; e dal Fondo Nazionale Svizzero per la Ricerca Scientifica (#310030_163260) a B. Keller. Vorremmo ringraziare i nostri colleghi, M. Figureroa e M. Miller (Università del Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (Università di Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (Università della California Berkeley), M. Wildermuth (Università della California Be....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Mulino a sfere MM400 | Retsch | 20.745.0001 | O mulino a sfere equivalente |
| 2 mL provette per fresatura a sfere | Sarstedt | 72.694.007 | |
| Sfere di fresatura in acciaio inox da 5/32" | OPS Diagnostics | GBSS 165-5000-01 | |
| Bagno d'acqua della serie 280 controllato da microprocessore Preimpostato su 65 ° C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | o bagnomaria equivalente |
| Bagnomaria serie 280 controllato da microprocessore Preimpostato su 37 ° C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | O equivalente bagnomaria |
| Eppendorf 5417R microcentrifuga refrigerata | Krakeler Scientific | 38-022621807 | O microcentrifuga equivalente |
| Chlorform: IAA (24:1 v/v) | Sigma-Aldrich | C0549 | Pericoloso in caso di contatto con la pelle o inalazione. Indossare guanti in nitrile, occhiali protettivi, camice da laboratorio e lavorare in cappa chimica |
| Fenolo:Cloroformio:IAA (25:24:1 v/v) | Thermo Fisher Scientific | 15593031 | Pericoloso in caso di contatto con la pelle o inalazione. Indossare guanti in nitrile, occhiali protettivi, camice da laboratorio e lavorare in cappa chimica |
| 100% isopropanolo | Sigma-Aldrich. | ||
| 100% etanolo | Sigma-Aldrich | 34923 | Freddo a -20 ° C uso precedente |
| Acetato di sodio | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Rnasi, senza DNA (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Metabisolfito di potassio | Sigma-Aldrich | P2522 | |
| Sodio Lauril Sacroinato | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | ||
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Bromuro di cetiltrimetilammonio (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269 | |
| Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme | Staples | 423263 | O occhiali equivalenti |
| Guanti in nitrile High Five COBALT, LARGE | Neta Scientific | HFG-N193 | O guanti equivalenti |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10.000x in acqua | Biotium | 41003 | |
| Bromuro di etidio 10 mg/mL | Biotium | 40042 | Pericoloso in caso di contatto con la pelle. Indossare guanti in nitrile e occhiali protettivi |
| Bioreagente ultrapuro di agarosio | VWR International LLC | JT4063 | |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific FERSM1332 | ||
| 8 - 48 kb CHEF Standard di dimensioni del DNA | Bio-Rad | 170-3707 | |
| Pippin Prep | Life Technologies Corporation | 4472172 | O aparato gel equivalente per campi pulsati |
| Carta da filtro qualitativa Whatman, Grado 1 | Sigma-Aldrich | Camera di | crescita WHA1001042 o equivalente |
| Camera di crescita Percival Percival AR66LXC9 | |||
| Spettrofotometro UV-Vis Nano | Fisher Scientific | ND-8000-GL | O spettrofotometro equivalente |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | |
| TAE Buffer (Tris-acetato-EDTA) (50x) | Thermo Fisher Scientific | B49 | Diluire 1/50 con acqua prima dell'uso (fino a 1x) |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Tris-Borato-EDTA, 10x Soluzione (Elettroforesi) | Thermo Fisher Scientific BP13334 | Diluire 1/10 con acqua prima dell'uso (fino a 1x) | |
| Azoto | Azoto liquido (-196 ° C) è un pericolo di congelamento. Inoltre, si espande rapidamente dopo il riscaldamento e non deve essere conservato in un contenitore ben chiuso |
Riferimenti
- Agrios, G. N. Plant Pathology. , 4th, Academic Press. (1969).
- Braun, U., Cook, R. T. Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews). , CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre Utrecht. The Netherlands. (2012).
- Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D.
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Ristampe e permessi
