Konformasjonelle fleksibilitet spiller en kritisk rolle i proteinfunksjon. Heri, beskriver vi bruken av tidsoppløst elektrosprayionisering massespektrometri koplet til hydrogen-deuterium-utveksling for sondering de hurtige strukturelle endringer som driver funksjon i bestilt og uordnede proteiner.
Egen uordnede proteiner (revet) har lenge vært en utfordring for å strukturelle biologer på grunn av deres mangel på stabile sekundære strukturelementer. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) målt ved hurtige tidsskalaer er unikt tilpasset for å detektere strukturer og hydrogenbindings nettverk som er kort bygde, slik at for karakterisering av transiente konformerer i native ensembler. Kobling av HDX massespektrometri gir flere viktige fordeler, blant annet høy sensitivitet, lav prøven forbruk og ingen begrensning på proteinstørrelse. Denne teknikken har avansert kraftig i de siste tiårene, inkludert muligheten til å overvåke HDX merking ganger på millisekund tidsskalaen. I tillegg, ved å inkorporere den HDX arbeidsflyten på et mikrofluidplattformen rommer en sur protease-mikroreaktor, er vi i stand til å lokalisere dynamiske egenskaper ved peptidet nivå. I denne studien, tidsoppløst elektrospray-ionisering Massespektrometri (Tresi-MS) som er koplet til HDX was brukes til å gi et detaljert bilde av gjenværende struktur i tau-protein, så vel som konformasjonelle endringer indusert ved hyperfosforylering.
I løpet av de siste tiårene, har betydelige fremskritt er gjort i utviklingen av analytiske teknikker utformet for å måle proteinstruktur og dynamikk 1, 2, 3, 4. Mens Røntgenkrystallografi forblir prinsippet verktøy for bestemmelse av proteinstruktur, blir høye konsentrasjoner av protein nødvendig, og omfattende optimalisering er nødvendig for å produsere diffraksjon kvalitet krystaller. Proteiner som er vanskelig å krystallisere, slik som membranbundne og egen uordnede proteiner er klassisk blitt studert ved hjelp av hydrogen-deuterium-utveksling (HDX) NMR 5. Men i de siste tiårene, kobling av elektrospray-ionisering massespektrometri (ESI-MS) for å HDX har raskt vunnet popularitet 6, 7.
Massespektrometri tilbyr en løsningtil mange av de begrensninger som følger av røntgenkrystallografi og NMR. Spesielt er svært følsom MS (nM til pM nødvendige konsentrasjoner), og det er praktisk talt ingen begrensning på proteinstørrelse. I tillegg er den høye driftssyklus av MS-analyse åpner for muligheten av å studere proteiner som de gjennomgår enzymatisk omsetning, misfolding, kompleksdannelse og andre biologisk relevante prosesser. Disse prosessene ofte forekommer på den andre millisekund til tidsskalaen og krever hurtig blanding av reagenser før analyse.
Utviklingen av Time-Løst elektrospray-ionisering (Tresi) av Wilson og Konermann i 2003 tillatt reaksjoner som skal overvåkes i pseudo-sanntid ved ESI-MS. Oppsettet deres innlemmet et kapillar-blander med en trinnløst innstillbar reaksjonskammer volum 8. Anordningen består av to konsentriske kapillærer, med den indre kapillær forseglet og et hakk skåret i dens side til å tillate blanding innenfor det smale inter-kapillærtey plass fra innsnittet til den ende av den indre kapillær (typisk 2 mm). Når det anvendes på HDX eksperimenter, vil det indre kapillarrør bærer for proteinet av interesse, bærer den ytre kapillarrør merkingen D2O løsning, som deretter underkastes blanding med proteinet før inntreden i regulerbar reaksjonskammeret slik at for HDX merking forut for direkte overføring til ESI kilde.
I korthet er avhengig HDX på ryggraden amid-hydrogener som gjennomgår utveksling med deuterium-atomer i oppløsning 9, 10. Utvekslingen er basekatalysert ved fysiologisk pH, sammen med syre-katalyse blir fremherskende ved pH under omkring 2,6. Kursen som er basert på fire hovedfaktorer: pH, temperatur, oppløsningsmiddel tilgjengelighet og intramolekylær hydrogenbinding. Som de tidligere to faktorer holdes konstant gjennom hele forsøket, frekvensen av utveksling, særlig ved peptidryggraden amid-posisjoner, er i første rekke dependent på proteinstruktur 11. Tett foldet regioner med omfattende og stabile hydrogenbindingsnettverk i a-helikser og p-ark vil ta opp deuterium ved vesentlig lavere priser i forhold til løkker og uordnede regioner (og noen ganger ikke i det hele tatt) 12. Dette gjør det mulig for global proteinanalyse, hvor forstyrrelsene i struktur (f.eks., Ved aggregering eller substratbindende) føre til ulik deuterium-opptaket (figur 1).
Den kinetiske kapillære blanderen kan bli inkorporert i et mikrofluidplattformen som inneholder et proteolytisk kammer for lokalisering av deuterium-opptak. Dette proteolytiske kammeret opprettholdes ved lav pH for effektivt å stanse utvekslingsreaksjon, og krever en immobilisert sur protease for å fordøye protein inn i lokaliserte peptider (figur 2). Overvåking ryggrad utveksling på millisekund til andre tidsskalaer er spesielt viktig forKarakteriseringen av konformasjonelle endringer innen vanskelige å karakterisere sløyfeområdene tilgjengelige, smeltet globuler, og egen uordnede proteiner (revet) 13, 14. Alternativt kan Tresi-HDX også benyttes for å karakterisere proteiner som for øyeblikket ikke har et løst atomstrukturen gjennom metoder for røntgen-krystallografi og NMR, ved hjelp av deuterium utveksling koblet til Corex algoritme (DX-Corex) tilnærming 15, 16. Denne detaljert protokoll skal gjelde Tresi-HDX å studere tau, en IDP, både i det opprinnelige form, så vel som det er sykdomsfremkallende hyperfosforylisert tilstand. Mens nativt tau er en av de mest studerte fordrevne, er lite kjent om dets amyloidogen motstykke 13.
Mens strukturbiologiske metoder, slik som røntgen-krystallografi og NMR er fordelaktige fordi de gir ekstremt detaljerte strukturer av proteiner, disse bildene er ofte statisk. Karakteriseringen av forbigående art og svakt strukturerte domener fortsetter å være unnvikende når undersøkt ved hjelp av disse konvensjonelle metoder. Derfor, for å få dynamisk innsikt i denne typen systemer er det viktig å arbeide på raske tidsskalaer. Vi har med hell brukt Tresi-HDX-MS for å få detaljert innsikt i de konforme endr…
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the ‘native’ tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.
Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75µm, OD: 150µm |
Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga – 89875K99 |
|
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
or | |||
Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
VersaLaser | Universal Laser | ||
Syringes | Hamilton | 81220 | 500µL capacity |
Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software/Online Tools | |||
CorelDraw X3 | Corel | ||
Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |