This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO•) probes (geNOps) to monitor single cell NO• fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO• formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.
Stikstofoxide (NO •) is een kleine groep, die verscheidene belangrijke cellulaire functies bemiddelt bij zoogdieren, bacteriën en planten. Ondanks het bestaan van een groot aantal werkwijzen voor het detecteren van NO • in vivo en in vitro, de real-time monitoring van NO • bij de enkele-celniveau is zeer uitdagend. De fysiologische of pathologische effecten van NO • worden bepaald door de werkelijke concentratie en de duur van deze radicale wonen. Dienovereenkomstig, methoden die de eencellige detectie van NO • Laat zijn zeer gewenst. Onlangs hebben we uitgebreid de pallet van NO • indicatoren introductie één fluorescerend eiwit gebaseerde genetisch gecodeerde stikstofoxide (NO •) probes (geNOps) die direct reageren op cellulaire NO • schommelingen en derhalve deze behoefte. Hier laten we het gebruik van geNOps intracellulaire NO • signalen in responsie op twee verschillende chemische NO • -liberating moleculen beoordelen. Onze resultaten also bevestigen dat vers bereide 3- (2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino) -N-methyl-1-propaanamine (NOC-7) een veel groter potentieel om veranderingen in intracellulaire NO • niveaus opwekken ten opzichte van de anorganische NO • nitroprussidenatrium (SNP). Bovendien tweekleurige levende cellen beeldvorming met de groene geNOps (G-geNOp) en de chemische Ca2 + indicator fura-2 werd uitgevoerd met de strakke regulatie van Ca2 + -afhankelijke visualiseren • NO vorming in één endotheelcellen. Deze vertegenwoordiger experimenten tonen aan dat geNOps zijn geschikte instrumenten om de real-time productie en afbraak van eencellige NO • signalen te onderzoeken in diverse experimentele opstellingen.
We hebben onlangs een nieuwe klasse van genetisch gecodeerde fluorescente NO • probes, zogenaamde geNOps 1. Deze sensoren bestaan uit een eenvoudig opgebouwd, bacterie-afgeleide NO • bindend domein 2, dat is geconjugeerd aan een verschillend fluorescerend eiwit (FP) variant 3 (cyaan, groen of oranje FP). NO • binding aan de niet-heem-ijzer (II) in het midden 4 geNOps verlaagt direct de fluorescentie-intensiteit 1. Belangrijk is dat de geNOps fluorescentie herstelt snel en volledig bij het intracellulaire NO • spiegels afnemen 1. Dienovereenkomstig geNOps mogelijk real-time beeldvorming van (sub) cellulaire NO • schommelingen. Hoewel de NO • sensing mechanisme van geNOps onduidelijk blijven tot nu toe hebben ze bewezen uitstekende NO • verslaggevers zijn, en dus hebben de potentie om het openen van een nieuw tijdperk van polychromatic, kwantitatieve NO • bioimaging met een hoge ruimtelijke en temporele resoluties 1, 5. Andere beschikbare fluorescerende NO • probes gebaseerd op kleine chemische verbindingen, die moeten in cellen worden geladen, en irreversibel gemodificeerd door NO • 6. Bijkomende nadelen van NO • gevoelige kleine fluoroforen hun mogelijke cytotoxiciteit en relatief lage specificiteit waardoor het moeilijk om ze te gebruiken in een betrouwbare, analytische en afdoende wijze 7, 8, 9. Hoewel de effectieve gebruik van genetisch gecodeerde fluorescente probes vereist efficiënte genoverdracht technieken hebben FP-gebaseerd genetisch gecodeerde sensoren voren als onmisbare hulpmiddelen die ons begrip van de inwendige werking van de cellen 10, 11 een revolutie. Voor de ontwikkeling van de interne FP-gebaseerde geNOps, een Förster resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde NO • sensor, aangeduid als NOA-1 12, geconstrueerd. Sato et al. ontwierp deze verfijnde probe die bestaat uit twee subeenheden van het NO • -gevoelige oplosbare guanylaatcyclase (sGC), beide geconjugeerd met FRET-gebaseerde sensoren melden cyclisch guanosine monofosfaat (cGMP) niveau 12. Aangezien deze probe reageert cGMP, alleen indirect detecteert intracellulaire NO • 12 fluctuaties. Hoewel de NOA-1 reageert op NO • verhogingen van de nano-molaire gebied, deze tool is nog niet vaak gebruikt tot nu toe, waarschijnlijk als gevolg van beperkingen ten aanzien van de beschikbaarheid en bruikbaarheid van deze omvangrijke tweedelige sensor.
Veelzijdige functies van NO •, die van invloed zijn fundamentele biologische processen zijn goed gekarakteriseerd 13, 14. Veel studies aangetoond dat de NO • concentration in cellen en subdomeinen bepaalt lot van de cel in gezondheid en ziekten 14, 15, 16. In zoogdieren, NO • voornamelijk enzymatisch gegenereerd in diverse celtypen door de goed gekarakteriseerde nitric oxide synthase (NOS) gezin 17. Tot nu toe zijn drie isovormen van NOS beschreven 18, 19, 20; Dit zijn de Ca2 + / calmoduline-afhankelijke endotheliaal NOS (eNOS of NOS-3) 18 en neuronaal NOS (nNOS of NOS-1) 19, en de Ca2 + / calmodulin-onafhankelijk constitutief actieve induceerbaar NOS (iNOS of NOS- 2) 20. Het bestaan van mitochondriaal NOS (mtNOS) is ook gesuggereerd 21. Echter, mtNOS wordt beschouwd als een splicing variant van nNOS en derhalve niet afzonderlijk geclassificeerd als isovorm 21. Een andere isovorm, behalve die in zoogdiercellen, is de zogenaamde bacteriële NOS (BNOS), vooral in gram-positieve bacteriën 22. De enzymatische productie van NO • is sterk gecontroleerde en afhankelijk van de beschikbaarheid van verschillende cofactoren zoals nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADPH), flavineadeninedinucleotide (FAD), tetrahydrobiopterine (BH4), moleculaire zuurstof en L-arginine 17. De kationische aminozuur L-arginine is het substraat dat wordt omgezet in L-citrulline op NO productie • 17. Naast de sterk gereguleerde enzymatische vorming van NO •, is gepostuleerd dat de groep niet-enzymatisch kan worden teruggebracht van nitriet pools mitochondria onder hypoxische omstandigheden 23. Zodra NO • wordt geproduceerd in een cel, kan het vrij diffunderen door biomembranen 14,ref "> 15. De korte halfwaardetijd van deze groep wordt vooral bepaald door de omstandigheden en verschillende paden en chemische reacties efficiënt afbreken NO • niveau 24. Uiteindelijk, de vorming, diffusie en afbraak van NO • afhangt op verschillende omgevingsparameters waarbij de effectieve concentratie van het biologisch zeer actieve molecuul 24 te bepalen.
De geNOps technologie maakt het mogelijk de directe detectie van (sub) cellulaire NO • fluctuatie 1 en is daarom geschikt om opnieuw te onderzoeken, en onlangs ontdekt de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de opbouw en afbraak van cellulaire NO • signalen. Hier bieden we eenvoudige protocollen en representatieve resultaten voor het gebruik van geNOps te visualiseren exogeen opgeroepen en endogeen gegenereerde NO • profielen, op het niveau van individuele cellen. Bovendien kan de geNOps techniek worden aangepast voor appassing in andere mobiele model systemen om de complexe patronen van NO • vorming, verspreiding en afbraak in reactie op diverse cellulaire stimuli en spanningen te bestuderen.
Sinds de ontdekking van NO • een belangrijk signaalmolecuul in de biologie 28, heeft de real-time meting van de groep in afzonderlijke cellen, weefsels en hele dieren met een hoge resolutie op een haalbare en betrouwbare wijze wordt nagestreefd. Hier melden wij de toepassing van recent ontwikkelde genetisch gecodeerd fluorescerende NO • probes (geNOps), die exact in staat live-cell imaging van NO • signalen met behulp van wide-field fluorescentie microscopie 1.
Om ingewikkelde en invasieve transfectie procedures te omzeilen HEK cel kloon die stabiel uitdrukt green fluorescent G-geNOp werd gebruikt voor het kwantificeren van exogeen geproduceerde single-cell NO • profielen. Zoals HEK cellen normaliter niet NO • endogeen 29 produceren, dit celtype geschikt voor het genereren van een geNOp-gebaseerde sensor cellijn, die nuttig zijn voor vele andere toepassingen in co-kweekomstandigheden misschienmet NO • het produceren van primaire cellen of zelfs in levende dieren 30. In deze studie demonstreren we het vermogen van diverse NO • -liberating verbindingen, verschillende concentraties en stabiliteiten, intracellulaire NO • signalen roepen met de G-geNOp expressie brengende HEK celmodel. Onze gegevens is de NO • -donor concentratie kwaliteit en toepassingsmethode uiteindelijk de patronen van intracellulaire NO • profielen bepalen. Dergelijke informatie is onmisbaar voor de in situ farmacokinetische karakterisering van verschillende NO • donoren, die indicatief zijn voor verschillende ziekten zijn. Met name zijn geNOps aangetoond om stabiel te reageren op meerdere herhaalde toepassingen van NO • -donor pulsen gedurende een zeer lange tijd 1. Bijgevolg heeft de experimenten met NO • -liberating verbindingen die hierin gepresenteerd, laat semi-kwantitatieve conclusies over de verschillende amplitudes en kinetiek van de respectieve cellulaire NO226; signalen (figuren 1 en 2).
Hoewel de stabiele wijze HEK-cel kloon waarschijnlijk uit een enkele cel, werd een brede heterogeniteit van G-geNOps expressieniveaus waargenomen (figuur 1). Dit is een algemeen kenmerk van stabiele celklonen de transcriptie van het (-genoom geïntegreerd) gen van belang onder de controle van veel factoren, zoals diverse omgevingsstress 31 dat celgroeisnelheden 32 beïnvloeden en de celcyclus status van 33. De single FP-gebaseerde geNOps niet-ratiometrische probes en dus de NO • geïnduceerde verlies van fluorescentie-intensiteit toeneemt met de geNOp expressieniveau 1. Dienovereenkomstig normalisatie van de geNOps signalen essentieel voor het kwantificeren van cellulaire NO • signalen vooral bij een vergelijkende analyse. Zoals getoond in onze recente studie, strikt lineaire correlatie between de basale fluorescentie-intensiteit van geNOps en de sterkte van de NO • geïnduceerde fluorescentie quenching over een breed scala van fluorescentie-intensiteiten gevonden 1. Dit is een belangrijk kenmerk van geNOps voor de absolute kwantificering van cellulaire NO • signalen. Zoals getoond in figuur 1, normalisatie van de G-geNOps signalen in responsie op NOC-7 en SNP bleek homogeen NO • signalen in verschillende HEK cellen van dezelfde plaat, wat aangeeft dat HEK cellen niet verschillend met betrekking tot hun vermogen te nemen en degraderen de NO • radicaal dat afkomstig is van de NO • donor. Daarentegen gebruiken geNOps in HeLa-cellen toonde duidelijke heterogeniteit van cellulaire NO • signalen tussen verschillende cellen in reactie op NOC-7. Deze verschillen wijzen op celtypespecifieke NO • metabolisme en afbraaksnelheden, die meerdere gevolgen celfysiologie en pathologie hebben, en kunnen worden ontdekt met behulp van de geNOps-technologie.
Niettemin twee belangrijke kenmerken van geNOps moeten zorgvuldig de juiste gebruik van de sensoren en data interpretaties beschouwd: i) geNOps hebben voldoende ijzer (II) om volledig aan NO • 1 en ii) afhankelijk van de FP variant geNOps kan zijn pH-gevoelige 1. Hier beschrijven we een protocol dat geschikt is bevonden voor toxische ijzer (II) aanvulling van geNOps die worden uitgedrukt in HEK, HeLa-cellen of EA.hy926 (zie protocol 2,6) te zijn. Terwijl is aangetoond dat cellen behandeld met ijzer (II) / vitamine C had geen invloed op celmorfologie, cel levensvatbaarheid en metabolische activiteit van cellen 1, kan het noodzakelijk om deze belangrijke stap voor andere celtypen en weefsels optimaliseren. In bepaalde experimentele omstandigheden, de eis van ijzer (II) geladen kan de toepasbaarheid van geNOps beperken. Met name is gebleken dat ascorbaat N kan verminderenO • 35 ascorbaat en ijzer (II) complexen kunnen vangen NO • 36, 37. Bovendien kan overtollige ijzer (II) ascorbaat en ontstekingsreacties 39 en loskoppelen eNOS 41 induceren. Dergelijke effecten moeten worden overwogen bij gebruik van de geNOps technologie. Er is aangetoond dat onder bepaalde experimentele omstandigheden, de intracellulaire pH wordt beïnvloed significant 34, die het potentieel om de fluorescentie geNOps 1 invloed heeft. Met name de cyaan en groene geNOps varianten relatief pH-gevoelige afname laat zien van fluorescentie na aanzuring 1. Vandaar misschien acute veranderingen in de (sub) cellulaire pH simuleren valse NO • signalen bij gebruik van de pH-gevoelige geNOps. Zoals voorgesteld in ons eerdere werk, de parallelle gebruik van NO • ongevoelig geNOps (geNOps mut) als negatief controls is aan te raden om te ontleden echte cellulaire NO • signaal van pH overstappen 1. Bovendien kan de cellulaire pH-wijzigingen worden geïnspecteerd door pH-sondes zoals Sypher 34.
Verder gevisualiseerd we de endogene enzymatische NO • vorming in reactie op een fysiologische Ca2 + -mobilizing agonist in de endotheelcellen surrogaat EA.hy926. De EA.hy926 cellijn is een veelgebruikte modelsysteem consequent uiting van eNOS 38. Het gebruik van geNOps tijdelijk tot expressie gebracht in EA.hy926 cellen, bevestigde dat IP-3-gemedieerde Ca 2+ signalen roepen diepe NO • vorming in dit type cel, die bijna volledig werd geblokkeerd door L-NNA. Om tijdelijk correleren Ca 2+ met NO • signalen werden G-geNOp expressie cellen opgeladen met het UV-prikkelbaar chemische Ca 2+ -indicator Fura-2 / uur. De spectrale scheiding van de Ca 2+ gebonden en ongebonden Fura-2 fluo cerend van de G-geNOp signaal kan gemakkelijk worden bereikt met in de handel verkrijgbaar filter sets 40. Beeldvorming beide probes onthulde dat de Ca2 + -triggered enzymatische NO • vorming komt veel trager in vergelijking met de cytosolische Ca2 + stijging van dit type endotheelcellen. Soortgelijke kinetiek van eencellige NO • signalen endotheelcellen van runderen longslagader bij celtherapie met de IP3 -generating agonist bradykinine, en schuifspanningen gemeld middels NOA-1, een indirecte sterk NO • -gevoelige sensor 12 . Dienovereenkomstig, deze gegevens benadrukken dat de Ca 2+ -evoked eNOS afgeleide NO • formatie vereist een zekere starttijd totdat het volledige enzymatische activiteit is bereikt. Hoewel de kinetiek van cellulaire NO • vorming, diffusie en afbraak kan worden gewonnen uit andere gegevens, zoals spanning metingen van NO • geïnduceerde relaxatie verblijfss = "xref"> 26, het grote voordeel van fluorescente NO • probes is dat ze direct omzetten cellulaire NO • fluctuaties in zichtbare signalen in real-time. Vandaar beeldvorming cellulaire NO • signalen geNOps biedt een hoge ruimtelijke en temporele resolutie, en biedt unieke mogelijkheden in (her) onderzoek naar de (sub) cellulaire NO • homeostase. Bijvoorbeeld beeldvorming eNOS pendelen 42 in combinatie met de technologie geNOps één endotheelcellen zou geschikt NO • formatie met de subcellulaire lokalisatie en translocatie van het NO • producerende enzym of andere relevante eiwitten zoals calmoduline en caveolin 43 correleren zijn.
Hier beschrijven we de haalbaar toepassing van G-geNOp expressie HEK en EA.hy926 cellen exogeen visualiseren en endogeen geproduceerde cellulaire NO • signalen op de single-celniveau en in real-time een conventionele breed fluorescentie microscope. Onze gegevens impliceren dat geNOps geschikt zijn om specifiek te volgen (sub) cellulaire NO • dynamiek onder verschillende experimentele omstandigheden met behulp van allerlei interessante celtypen.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA for providing the EA.hy926 cells. Author E.E. is supported by Nikon Austria within the Nikon-Center of Excellence, Graz and is a fellow of the Ph.D. program in Molecular Medicine at the Medical University of Graz. The researchers are also supported by the Ph.D. program Metabolic and Cardiovascular Disease (DK-W1226) of the Medical University of Graz. This work was also funded by the FWF project P 28529-B27. Microscopic equipment is part of the Nikon-Center of Excellence, Graz that is supported by the Austrian infrastructure program 2013/2014, Nikon Austria Inc., and BioTechMed, Graz.
NaCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.20 | sodium chloride |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.1 | potassium chloride |
CaCl2 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T885.1 | calcium chloride dihydrate |
MgCl2 .6H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | magnesium chloride hexahydrate |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.3 | 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8551.1 | sodium hydrogencarbonate |
KH2PO4 | Merck, Darmstadt, Germany | 104873 | potassium dihydrogen phosphate |
Na2HPO4 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.1 | sodium hydrogenphosphate dihydrate |
D(+)-Glucose monohydrate | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | >99.5%; for cell culture, endotoxin free; |
EGTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3054.2 | ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; calcium chelating agent |
NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6771.1 | sodium hydroxide |
HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4625.1 | hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N) |
DMSO | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | dimethyl sulfoxide; highly polar, aprotic organic solvent |
L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | G2128 | (S)-2-Aminoglutaric acid |
DMEM, low glucose | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | D5523 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose; with 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
MEM Vitamin solution (100X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11120037 | 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
MEM Amino acids solution (50X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11130036 | 50X the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122.00 | antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures |
Amphotericin B | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15290026.00 | Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi |
FCS | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270106 | Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin |
PBS, pH 7.4 | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010031.00 | phosphate-buffered saline |
Fura-2 (AM) | Teflabs, Austin, TX, USA | 102 | fluorescent cytosolic calcium indicators |
Histamine dihydrochlorid | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | H7250 | 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist |
Nω-Nitro-L-arginine | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | N5501 | N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA; inhibitor of nitric oxide synthase |
NOC-7 | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 487952 | 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release |
Sodium nitroprusside dihydrate | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-203395A | sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound |
30-mm Cover slips | Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany | 41001130 | glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30-mm, (VE: 100 pcs.) |
Iron(II) booster solution | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/ |
G-geNOp plasmid | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product/g-genop/ |
G-geNOp AAV5 | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/ |
G-geNOp sensor cell line | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/ |
HEK293A cell line | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R70507 | subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) |
EA.hy926 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany | CRL-2922 | somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549 |
TILL iMIC | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | digital microscope |
Polychrome V monochromator | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | ultra fast switching |
AVT Stingray F145B | Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany | n.a. | Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b |
alpha Plan Fluar 40 | Zeiss, Göttingen, Germany | n.a. | x40 objective |
dichroic filters | Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA | n.a. | GFP emitter 514/3 nm (515dcxr) |
ValveBank8 Controller | AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA | 01-08 | programmable perfusion system control unit |
BVC control | Vacuubrand, Wertheim, Germany | 727200 | Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system |
ImageJ software | NIH Image | Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome |