키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해
Summary
서로 다른 유전 적 배경에서 개별 WT 망막 전구 세포의 실시간 추적은 신경 동안 셀이 아닌 자율적 인 신호의 기여도의 평가를 할 수 있습니다. 여기서, 배아 이식을 통한 생체 저속 촛점 촬상 유전자 녹다운, 키메라 세대의 조합이 목적을 위해 사용 하였다.
Abstract
유전 적 및 기술적 장점은 제브라 척추 유전자 조작의 결과가 급속한 발달 기간 동안 생체 내에서 추적 될 수있는 키 모델 생물 만들었다. 다중 처리는 세포 증식, 유전자 발현, 세포 이동 및 형태 형성을 포함하여 연구 될 수있다. 중요한 것은, 이식을 통해 키메라의 생성을 용이하게 호스트 환경의 영향하에 모자이크 표시와 개별 세포의 추적을 가능하게 수행 될 수있다. 예를 들어, 개별 이식 공여자 세포 (모르 폴리 마이크로 인젝션을 통해 예를 들어) 호스트 배아 기능 유전자 조작 및 라이브 영상, 외부의 영향 (유 전적으로 변형 환경에 의해 제공되는) 셀 비 자립적 신호를 조합하여 평가 될 수있다. 여기서 우리는이 방식 세포 운명 determin의 타이밍에 대한 프록시로서 형광 유전자 발현의 개시를 비교하기 위해 사용되는 방법을 보여다른 유전 호스트 환경에서 ATION.
이 글에서 공여 세포를 표시 유전자 호스트 배아 최저 키메라 배아를 생성하는 데 사용되는 이식 기술을 설명하고, 제조 및 생체 저속 촛점에서 실행을위한 프로토콜을 일으킬 제브라 피쉬 배아 마이크로 인젝션을위한 프로토콜을 제공 여러 개의 배아의 영상. 이러한 유전자 발현의 개시에 따라 이벤트의 타이밍을 비교하면 특히 다단 촬상을 행하는 것은 매우 중요하다. 이것은 다수의 제어와 동시에 처리 실험 배아에서 데이터 수집이 필요합니다. 이러한 접근 방식은 쉽게 장기 나 영상을 살 액세스 선택의 조직에서 외부의 영향에 대한 연구를 위해 확장 될 수있다, 이식이 이루어 배아 운명의지도에 따라 쉽게 대상이 될 수 있음을 제공했다.
Introduction
생체 내 척추 동물의 중요한 발달 과정을 시각화하는 능력은 정상과 질병 조건을 공부 제브라 피쉬에게 키 모델을 만들기에 기여하고있다 (1 검토, 2). 특히, 신경 망막은 중추 신경계의 접근 가능한 부분이다. 망막 인해 고도로 조직 아직 비교적 간단한 구조 및 척추 동물 종 3에서 고도로 보존 된 신경 세포 유형에 쉽게 신경의 연구를 수행하기 위해 빌려 준다. 이러한 증식, 세포주기 출구, 비대칭 세포 분열, 운명 사양, 차별화 및 신경 회로의 형성과 같은 세포 행동의 역학은 3 일의 postfertilization에 의해 제브라 피쉬의 중심 망막에 완료 retinogenesis의 전체 과정에 걸쳐 올 수 있습니다 ( DPF) 4, 5,REF "> (6, 7).
또한, 전술 한 각 단계에서 상이한 유전자의 기능적 요구 병용 단 후 부검시에 평가 될 수있는 유전자 녹아웃 기술의 적용으로 인한 표현형 다른 척추 동물 모델에 비해 이점을 제공 제브라 망막 평가할 수있다 의 조직을 고정. 특히, 시각화 및 망막 리포터 유전자 형광 단백질의 발현을 모니터 할 수있는 트랜스 제닉 라인의 사용은 우리가 특정 신경 세포 유형 기원의 기초의 유전자 발현의 시간 해상도를 얻을 수있다. 인해 지브라 피쉬의 급속한 발전으로, 이러한 이벤트는 따라서 신경 세포 식별 획득 및 셀의 동작과 관련하여 유전자 발현의 시간 중요도에 깊은 통찰력을 제공하여 전체 개발 기간을 시각화 할 수있다.
마지막으로,이 방법은 유전자 기능의 두 가지 주요 형태로 통계 결과 이식을 통해 키메라의 생성과 제브라 효율적으로 결합 될 수있다. 우선, 그들이 비 표지 야생형 환경에서 개발하면서 특정 유전자를 넉다운시킨 도너 배아에서 이식 세포 검사, 세포 자율 방식으로 유전자 기능에 대한 관련 정보를 얻을 수있게 해준다. 따라서, 그들은 일반적으로 더 이상 유전자 -4,6-에서 기능성 단백질을 생성 할 수 없다 전구 세포의 발달 운명 결과의 시험을들 수있다.이 표현되는 전구 세포 내 망막 운명 결정 인자의 기능에 관한 중요한 통계 리드 8,9. 이 방법을 활용하여, 우리는 많은 운명의 결정 요인 (예를 들어, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2가) 세포의 역할을하는 것으로 나타났습니다-autonomously 특정 망막 신경 세포의 운명을 구동하는 단계; 유전자 발현의 부족은 주로 유전자 녹다운 세포가 다른 세포 운명 4, 6, 7, 10을 채용하여 생존 유지되도록 운명 스위치로 이끈다. 둘째, 이러한 키메라 실험은 서로 다른 유전 적 환경에서 개발할 때 형 선조 동작 방식 야생 평가하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 일반적으로 조작 된 호스트 환경 (예를 들어, 유전자 녹아웃 / 최저) 대 WT 관심 (리포터 유전자)의 유전자를 발현 WT 세포의 발달을 비교하여, 유전자 발현 및 세포 운명 얻어진 효과를 평가할 수있다 . 호스트 환경의 특정 신경 세포 유형의 부재가 예를 들어, 소수 O로 분화 향해 바이어스 그들 셀 비 자율 방식으로 야생형 전구 동작에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다신경 세포 타입 4, 7, 11, 12을 r에 누락. 망막 신경 세포가 (13에서 검토) 특정 신경 세포 운명 결정하는 유전자의 순차적 초과 식 (운명의 유전자 발현)에 의해 보존 histogenic 위해 태어난 것을 감안할 때, 우리는 입증하기 위해 이러한 방법을 사용하는 방법 야생형 전구 세포의 운명 유전자 발현의 타이밍 이러한 전구 세포가 유도 된 비정상적인 세포 조성 망막 호스트 환경에서 개발할 때 영향을받습니다. 비교적 널리 사용되는 표준 및 기술의 조합은 망막 전구 세포를 8, 9 개발 운명 유전자 발현의 타이밍의 시험을 가능하게하는 방법을 여기에서는 증거 이러한 방법을 설명합니다.
이 프로토콜은 당의 용이성으로 시간 경과 영상을 결합하는 실험 방법을 설명합니다전 생체 개발 제브라 피쉬 배아에 이식을 형성하는 개별 mosaically에게 발달 retinogenesis의 전체 기간 동안 표지 세포를 수행합니다. 기능 유전자 조작을 수행함으로써 어느 호스트 배아 도너 배아, 또는 둘 모두에서 하나의 유전자 기능의 셀 자율성을 평가할 수있다. 이 방법은 여기에 설명 된 개별 구성 요소가 적합있는 다른 시스템에서 유사한 연구 질문에 널리 적용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
효율적 특정 포스트 – 유사 분열 세포 유형 또는 패터닝 된 조직으로 분화하는 배아 또는 유도 된 다 능성 줄기 세포를 지시하는 것을 목표로 할 때 넓이가있는 이웃하는 셀은 중요한 세포의 운명 결정 인자의 발현의 타이밍에 영향을 이해하는 것이 필수적이다. 또한, 살아있는 동물의 개발 세포에서 이러한 분자 이벤트를 검사하면 추가로 관련 동적 생체 내에서 이러한 이벤트와 관련된 특…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 (PO 1440 / 1-1) LP하는 PRJ에 ARC DECRA (DE120101311)에 의해과 독일 연구 협회 (DFG)의 연구 보조금에 의해 지원되었다. 호주 재생 의학 연구소는 빅토리아 주 정부와 호주 연방 정부의 자금 지원됩니다. 우리는 케이 등의 알에 게시 여기에 기술 된 실험을 실시 박사 제레미 잉 치 케이를 인정합니다. 2016 년 우리는 교수 Higashijima에서 형질 전환 어류의 규정에 대한 감사 및 PROFS 감사합니다. H2B-RFP 및 H2A-GFP 구조를 생성하기위한 PCS2 + 플라스미드 박사 윌킨슨의 제공을위한 터너와 렆. 우리는 우리의 동물을 돌보는에 대한 FishCore 시설 직원 (모나 쉬 대학) 감사합니다.
Materials
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C |
| Agarose low melt | Sigma | A9414-100G | Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted). |
| borosillicate glass capillary tube w/o filament | SDR Scientfic | 30-0035 | alternatives with similar diameter can be used |
| borosillicate glass capillary tube with filament | SDR Scientfic | 30-0038 | alternatives with similar diameter can be used |
| glass petri dishes (60 mm diameter) | Science Supply | 1070506 | any glass alternative of any size |
| Injection tube (2m) | Eppendorf | 524616004 | This connects the needle holder to the syringe during transplantation |
| Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) | Adaptive Science Tools | PT-1 | alternatives with similar shape can be use |
| microneedle holder | Narishige | M-152 | any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used |
| microinjector | Narishige or Eppendorf Femtojet | Pneumatic injector using gas pressure | |
| micromanipulator | Coherent Scientific | M330IR | similar alternatives can be used |
| microloader tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904-500ML | |
| needle puller | Sutter Instruments | Model P-2000 | Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension |
| Parafilm | Interpath | PM996 | any paraffin film |
| Pasteur pipette plastic | Samco Scientific | 202 | |
| Pasteur pipette glass | Hirschmann Laborgeraete | 9260101 | |
| Pronase | Sigma | P5942-25MG | Protease Type XIV |
| N-phenyl thiourea | Sigma | P7629-25G | PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use. |
| Qiaquick gel extraction | Qiagen | 28704 | any alternatives to purify DNA can be used |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | any alternatives to purify RNA can be used |
| SP6 mMessage kit | Qiagen | AM1340 | any alternatives to transcribe DNA using SP6 |
Riferimenti
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