В визуализации in vivo трансгенной экспрессии генов в Персональной Ретинального прародителей в химерных эмбрионов данио рерио по изучению мобильных неавтономных Влияния

Summary

Живая отслеживание отдельных WT клеток-предшественников сетчатки в различных генетических фонов позволяет для оценки вклада клеток неавтономных сигнализации во время нейрогенеза. Здесь, сочетание гена нокдаун, химеры поколения с помощью трансплантации эмбрионов и в естественных условиях покадровой конфокальной микроскопии был использован для этой цели.

Abstract

Генетические и технические достоинства сделали данио позвоночное ключевой модель организма , в котором последствия генных манипуляций можно проследить в естественных условиях в течение всего периода быстрого развития. Несколько процессов могут быть изучены в том числе пролиферацию клеток, экспрессию генов, миграции клеток и морфогенеза. Важно отметить, что образование химер с помощью трансплантаций могут быть легко выполнены, что позволяет маркировки мозаики и отслеживание отдельных клеток под воздействием принимающей среды. Например, путем комбинирования функциональных генов манипуляциями хозяина эмбриона (например, посредством морфолино микроинъекции) и живого изображения, эффекты примесной, клеточные сигналы неавтономные (предоставляемые генетически модифицированной среды) , на отдельных пересаженных донорских клеток могут быть оценены. Здесь показано, как этот подход используется для сравнения начало флуоресцентного трансгенной экспрессии как прокси-сервер для синхронизации клеточных судеб determinвания в различных средах генетический хост.

В этой статье мы предлагаем протокол для microinjecting эмбрионов данио , чтобы отметить донорских клеток и вызывать ген нокдаун в принимающих эмбрионов, описание методики трансплантации , используемой для получения химерных эмбрионов, а также протокол для подготовки и проведения в естественных условиях покадровой конфокальной визуализация нескольких эмбрионов. В частности, выполняя функции многопозиционного визуализации имеет решающее значение при сравнении времени событий, таких как начало экспрессии генов. Это требует сбора данных из нескольких контрольных и экспериментальных эмбрионов, обработанных одновременно. Такой подход может быть легко расширена для изучения внешних воздействий в любом органе или ткани выбора доступной для живого изображения, при условии, что трансплантация может быть легко направлены в соответствии с установленными эмбриональных карт судьбы.

Introduction

Способность визуализировать важные процессы развития в в естественных условиях позвоночных животных способствовало делает данио ключевую модель для изучения нормальных и болезненных условий (обзор в ^{1, 2).} В частности, нейронная сетчатка является доступной частью центральной нервной системы. Сетчатка поддается легко выполнять исследования нейрогенеза в связи с его высокоорганизованной, все же относительно простую структуру, и его высоко консервативных типов нейронов через ³ видов позвоночных. Динамика клеточных поведения, таких как пролиферация, выхода из клеточного цикла, асимметричного деления клеток, спецификации судьбы, дифференциации и формирования нейронной электрической схемы можно проследить на протяжении всего процесса ретиногенеза, который завершается в центральной сетчатки данио на 3 г после оплодотворения ( DPF) ^{4, 5,}исх "> ^{6, 7.}

Кроме того, функциональные требования различных генов в каждом из указанных выше этапов могут быть одновременно оценены в данио сетчатки, обеспечивая преимущество по сравнению с другими позвоночными моделями, в которых фенотипы в результате применения методов нокаут гена может быть оценена только после аутопсии фиксированных тканей. В частности, использование трансгенных линий, в которых мы можем визуализировать и контролировать экспрессию флуоресцентных белков как репортер трансгенов в сетчатке, позволяет получить временное разрешение экспрессии гена, лежащего в основе генезиса определенного нейронного типа клеток. В связи с быстрым развитием данио, эти события могут быть визуализированы в течение всего периода развития, тем самым обеспечивая более глубокое понимание важности временной экспрессии генов в связи с приобретением нейрональной идентичности клеток и поведения клеток.

И, наконец, эти подходы могут быть объединены эффективно в данио рерио, при генерации химер через трансплантаций, в результате проникновения в суть двух ключевых аспектов функции гена. Во-первых, исследуя клетки, пересаженные от донора эмбриона, в котором конкретный ген был нокдаун в то время как они развиваются в среде немеченного дикого типа, позволяет получить необходимую информацию о функции гена в клетке-автономным способом. Это приводит к важным более глубокое представление о функции сетчатки глаза факторов судьбы определителем внутри клеток – предшественников , они , как правило , выражается в. Это можно проиллюстрировать на примере рассмотрения развития исхода судьбы клеток – предшественников , которые больше не могут генерировать функциональный белок из этих генов ^{4, 6, 8, 9.} Используя этот подход, мы показали , что многие судьбы определяющих факторов (например, vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) действуют ячейки-autonomously водить специфические нейронные сетчатку судьбы; отсутствие экспрессии генов в первую очередь , приводит к судьбы переключателя, таким образом, что клетки с геном нокдауна сохраняют жизнеспособность путем принятия альтернативной клеточной судьбы ^{4, 6, 7, 10.} Во-вторых, такие химерные эксперименты могут быть использованы для оценки того, как дикого типа клетки-предшественники ведут себя, когда они развиваются в различных генетических средах. Например, путем сравнения развития клеток WT , которые обычно выражают представляющий интерес ген (и репортер трансгена) в WT в сравнении манипуляций среде хоста (например, ген Нокаут / бросовой), которые воздействуют на экспрессию генов и судьбу клетки могут быть оценены , Отсутствие определенных типов нейронов в принимающей среде, например, было показано, что влияние на поведение клеток-предшественников дикого типа в клетке неавтономных образом, чтобы смещать их к дифференцировке в недопредставленного Oг отсутствуют типы нейронные ^{4, 7, 11, 12.} Учитывая , что нейроны сетчатки рождаются в консервативном histogenic порядке по последовательно приуроченной экспрессии специфических нейрональных генов судьбы определитель (экспрессии генов судьбы) (обзор в ^13), мы использовали эти методы , чтобы продемонстрировать , как выбор времени экспрессии генов судьба в предшественниках дикого типа влияет, когда такие клетки-предшественники развиваются в сетчатку средах хозяев с индуцированными аберрантных клеточных композиций. Здесь мы опишем эти подходы в качестве доказательства для того, как сочетание относительно стандартных и широко используемых методов позволяет изучение сроков экспрессии генов судьбы в развитии клеток – предшественников ретинальных ^{8, 9.}

Этот протокол описывает экспериментальный подход, включающий покадровой обработки изображений с легкостью вформирование трансплантации в естественных условиях экс развивающегося эмбриона данио следовать отдельному мозаично меченых клеток на протяжении всего периода ретиногенеза развития. Выполняя функциональные манипуляции генов либо в принимающем зародыша, донора эмбриона, оба или ни, можно оценить автономию клеток функции гена. Такой подход может быть широко адаптировано для аналогичных исследовательских вопросов в любой другой системе, для которых отдельные компоненты, описанные здесь, являются подходящими.

Protocol

Все процедуры были проведены в соответствии с положениями Австралийского Национального исследовательского совета по здравоохранению и медицинским кодекс практики по уходу и использованию животных и были одобрены институциональными комитетами по этике. 1. Приготовлен…

Representative Results

Эта работа представляет собой экспериментальный протокол для оценки изменений в сроках экспрессии генов, когда клетки-предшественники сетчатки дикого типа развиваются в morphant эмбриона хозяина. Экспериментальные эмбрионы хозяева Ptf1a морфанты, которые испытывают нед?…

Discussion

Понимание того, в какой степени влияют на соседние клетки времени экспрессии решающим клеточных судеб определяющих факторов имеет важное значение при прицеливании эффективно инструктировать эмбриональные или индуцированные мультипотентны стволовых клеток дифференцироваться в оп?…

Materials

Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6