In vivo avbildning av Transgena genuttryck i Individuell Retinal stamceller i chimär Zebrafish embryon att studera Cell Nonautonomous Influenser

Summary

Live spårning av enskilda WT retinala stamceller i olika genetiska bakgrunder gör det möjligt att bedöma bidrag cells non-autonom signalerings under neurogenes. Här, var en kombination av gen knockdown, chimär generation via embryotransplantation och in vivo tidsförlopp konfokal avbildning utnyttjas för detta ändamål.

Abstract

De genetiska och tekniska styrka har gjort zebrafisk ryggradsdjur en viktig modellorganism i vilken konsekvenserna av genen manipulationer kan spåras in vivo under den snabba utvecklingstiden. Flera processer kan studeras inklusive celltillväxt, genuttryck, cellmigration och morfogenes. Viktigt kan generering av chimärer genom transplantationer lätt utföras, så att mosaik märkning och spårning av individuella celler under inverkan av den mottagande miljön. Till exempel, genom att kombinera funktionell gen manipulationer av värd embryot (t.ex., genom morfolino mikroinjektion) och levande avbildning, effekterna av yttre, cell nonautonomous signaler (tillhandahålls av genetiskt modifierade miljön) på enskilda transplanterade donatorceller kan bedömas. Här kan vi visa hur denna metod används för att jämföra uppkomsten av fluorescerande transgen expression som en proxy för tidpunkten för cell öde fastställbaraation i olika genetiska värdmiljöer.

I denna artikel ger vi protokollet för microinjecting zebrafisk embryon för att markera givarceller och orsakar gen knockdown i embryon värd, en beskrivning av transplantationsteknik används för att generera chimära embryon, och protokollet för att förbereda och köra in vivo tidsförlopp konfokala avbildning av multipla embryon. I synnerhet utför multiposition avbildning är avgörande när man jämför tidpunkten för händelser såsom starten av genuttryck. Detta kräver insamling av uppgifter från flera kontroll- och experiment embryon behandlas samtidigt. En sådan strategi kan lätt utvidgas för studier av yttre påverkan i något organ eller vävnad av val tillgängliga för bildåtergivning i realtid, under förutsättning att transplantationer kan riktas lätt enligt fastställda embryonala öde kartor.

Introduction

Förmågan att visualisera viktiga utvecklingsprocesser i ett in vivo ryggradsdjur har bidragit till att göra zebrafisk en viktig modell för att studera normala och sjukdomstillstånd (översikt i ^{ett, två).} I synnerhet är neurala näthinnan en tillgänglig del av det centrala nervsystemet. Näthinnan lämpar sig för enkelt utföra studier av neurogenes på grund av dess mycket organiserat, men ändå relativt enkel struktur, och dess starkt konserverade neuron typer över ryggradsdjur ^3. Dynamisk av cellulära beteenden såsom proliferation, cellcykel exit, asymmetrisk celldelning, öde specifikation, differentiering och neurala kretsar bildning kan följas genom hela processen av retinogenesis, som är klar i den centrala näthinnan av zebrafisk med 3 d postfertilization ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Dessutom kan de funktionella kraven för olika gener i var och en av de ovan nämnda stegen att samtidigt bedömas i zebrafisk näthinnan, vilket ger en fördel jämfört med andra ryggradsdjur modeller där fenotyper i samband med tillämpningen av genen knockout tekniker kan bara bedömas efter obduktion av fast vävnader. I synnerhet, användningen av transgena linjer i vilka vi kan visualisera och övervaka uttrycket av fluorescerande proteiner som reportertransgener i näthinnan, tillåter oss att erhålla tidsupplösning av genuttryck som ligger bakom uppkomsten av en speciell neuronal celltyp. På grund av den snabba utvecklingen av zebrafisk, kan dessa händelser visualiseras under hela utvecklingsperioden, varigenom djupare insikter i den tidsmässiga betydelsen av genuttryck i förhållande till neuronal cellidentiteten förvärv och cellbeteende.

Slutligen kan dessa metoder kombineras på ett effektivt sätt i zebrafisk med genereringen av chimären via transplantationer, vilket resulterar i en inblick i två viktiga aspekter av geners funktion. För det första att undersöka celler transplanterade från en donator embryo, i vilken en särskild gen slogs ned medan de utvecklas i en omärkt vildtyp miljö, tillåter oss att få relevant information om geners funktion i en cell-självständigt sätt. Detta leder till viktiga insikter om funktionen av retinala öde bestämningsfaktorer inom stamceller som normalt uttrycks i. Detta exemplifieras genom undersökning av utvecklings öde resultatet av stamceller som inte längre kan generera funktionellt protein från dessa gener ^{4, 6, 8, 9.} Med hjälp av denna metod, har vi visat att många öde bestämningsfaktorer (t.ex. Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) agera cell-autonomously att köra specifika retinala neuronala öden; bristen på genexpression leder i första hand till ett öde omkopplare, så att cellerna med genen knockdown förbli livskraftig genom att anta en alternativ cellöde ^{4, 6, 7, 10.} För det andra kan sådana chimära experiment kan användas för att bedöma hur vild typ stamceller beter sig när de utvecklar inom olika genetiska miljöer. Till exempel, genom att jämföra utvecklingen av WT-celler som vanligtvis uttrycker en gen av intresse (och reporter transgen) i en WT kontra manipulerad värdmiljön (t.ex. gen knockout / knockdown), de resulterande effekterna på genuttryck och cell öde kan bedömas . Bristen på vissa neuron typer i värdmiljön, till exempel, har visat sig påverka vildtyp gångarbeteende i en cell icke-självständigt sätt, för att pressa dem mot differentiera till det underrepresenterade or saknas neuron typerna ^{4, 7, 11, 12.} Med tanke på att näthinnans nervceller föds i en konserverad histogenic order av sekventiellt tids uttrycket av specifika neuronala öde bestämnings gener (ödet genuttryck) (översikt i ^13), använde vi dessa metoder för att visa hur tidpunkten för ödet genuttryck i vild typ stamceller påverkas när sådana stamceller utvecklas i näthinnan värd miljöer med inducerade avvikande cellulära kompositioner. Här, vi beskriva dessa metoder som bevis för hur kombinationen av relativt vanliga och mest använda tekniker gör det möjligt att undersöka tidpunkten för ödet genuttryck i utvecklingen av retinala stamceller ^{8, 9.}

Detta protokoll beskriver en experimentell metod som kombinerar tidsförlopp avbildning med enkel perbildande transplantation i ex vivo utveckla zebrafisk embryo att följa individuella mosaically märkta celler under hela perioden av utvecklings retinogenesis. Genom att utföra funktionell gen manipulationer antingen i värd embryo, givare embryo, båda eller ingen, kan man bedöma cell autonomi av geners funktion. Detta tillvägagångssätt kan anpassas i stor utsträckning på liknande frågeställningar i något annat system för vilka de enskilda komponenterna som beskrivs här är lämpliga.

Protocol

Alla förfaranden genomfördes i enlighet med bestämmelserna i Australian National Health och Medical Research Council uppförandekod för skötsel och användning av djur och godkändes av institutionella etiska kommittéer. 1. Framställning av Zebrafish Vuxna fiskar parning Inrätta vuxna fiskar som par (eller två par) i lämplig storlek avelstankar kvällen före användning. För att hålla den kvinnliga separeras från den manliga, använda en avdelare f…

Representative Results

Detta arbete presenterar ett experimentellt protokoll för att bedöma förändringar i genuttryck timing när vildtyp retinala stamceller utvecklas inom en morphant värd embryo. De experimentella värd embryon är Ptf1a morphants, som saknar de mellanliggande födda horisontella och amakrina interneuronen av näthinnan 7, 26. Dessa har i jämförelse med kontroll värd embryon som injicerades med en standardkontroll morfolino. …

Discussion

Förstå vilken utsträckning angränsande celler påverkar tidpunkten för uttrycket av avgörande cell öde avgörande faktorer är avgörande när syftet är att på ett effektivt sätt instruera embryonala eller inducerade multi stamceller att differentiera till en specifik post-mitotiska celltyp eller mönstrad vävnad. Dessutom undersöker dessa molekylära händelser i utvecklings cellerna i levande djur dessutom ger relevant dynamiska (tid och rum) information om de särskilda cellulära sammanhang i samband med…

Materials

Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6