Atomic Force Microscopy Onderzoek naar DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair
Summary
Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.
Abstract
AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.
Introduction
Atomische krachtmicroscopie (AFM) is een krachtige techniek voor de analyse van eiwit-DNA-interacties 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Het vereist slechts lage hoeveelheden monstermateriaal om heterogene monsters rechtstreeks te visualiseren met een resolutie op het molecuulniveau. Heterogeniteit kan resulteren uit verschillende conformatieve of oligomere toestanden van een eiwit. In het bijzonder kunnen eiwitcomplexen in het kader van eiwit-DNA-monsters verschillende stoichiometrieën en / of conformaties veroorzaken die geïnduceerd zijn door DNA-binding in het algemeen of aan een specifieke doelplaats in DNA binden. Heterogene monsters kunnen ook twee (of meer) verschillende soorten eiwitten bevatten en een ander eiwitcomplexVormen (bijvoorbeeld bestaande uit slechts één type eiwit versus heteromeer complexen) kunnen verschillen met DNA. De hier beschreven studies maken gebruik van AFM-beeldvorming in lucht op statische, gedroogde monsters van DNA-reparatie-eiwitten die gebonden zijn aan lange (~ 900 basisparen, bp) DNA-fragmenten die een letsel bevatten, die een doelstelling voor deze eiwitten vertegenwoordigt. De hoge moleculaire resolutie van AFM maakt het onderscheid mogelijk tussen verschillende typen eiwitcomplexen en om de bindingsposities van de eiwitten op de DNA-fragmenten te bepalen. Het is belangrijk dat de laesies in de DNA-substraten worden ingevoerd bij goed gedefinieerde posities. Omdat de positie van de laesieplaats in het DNA bekend is, geven de verdelingen van eiwitten die gebonden zijn aan DNA inzicht in (verschillende) laesieherkenningseigenschappen van de (verschillende) eiwitcomplexen, bijvoorbeeld hoe goed ze een bepaald type laesie herkennen (vergeleken Naar niet beschadigd DNA) 2 , 3 , <supClass = "xref"> 4 , 5 , 6 . Hun posities op het DNA maken het onderscheid mogelijk tussen eiwitcomplexen die specifiek gebonden zijn aan de laesies en complexen die niet specifiek gebonden zijn elders op het DNA. Afzonderlijke karakterisering van deze verschillende complexe typen (complexen die specifiek zijn gebonden aan de lesie versus niet-specifieke complexen) kunnen potentiële conformatieve veranderingen onthullen in de complexen die zijn geïnduceerd bij de identificatie van de doelplaats.
De DNA-herstellingsproteïnen die hierop gericht zijn, zijn helicasen die verantwoordelijk zijn voor de herkenning van de laesie in de nucleotide-excisie-reparatie (NER) -weg. Bij bacteriën wordt NER bereikt door de eiwitten UvrA, UvrB en UvrC. UvrA is verantwoordelijk voor het aanvankelijke letselsensor in een UvaA 2 / UvrB 2 DNA-scanningskomplex. Bij laesieverificatie door UvrB converteert dit complex naar monomere UvrB gebonden op de lesion site en dit specifieke complex kan dan de pRokaryotische NER endonuclease UvrC. UvrC exciseert een korte (12-13 nt) streep van enkelstrengs DNA (ssDNA) dat de laesie bevat. Het ontbrekende rek wordt dan door DNA-polymerase opgevuld. Ten slotte sluit DNA ligase de nieuw gesynthetiseerde rek met het originele DNA 9 , 10 . In eukaryoten zijn de meeste eiwitten van de NER-cascade onderdeel van het grote, multimere transcriptiefactor II H (TFIIH) complex. Na aanvankelijke letselsensor via het trimerische CEN2-XPC-HR23B-complex, wordt TFIIH aangeworven op de DNA-doelplaats. Wanneer XPD binnen het complex de aanwezigheid van een NER-targetletsel verifieert, worden de eukaryote NER-endonucleasen XPG en XPF aangeworven om een korte (24-32 nt) streep van ssDNA die de letsel 9 , 10 bevat , te accijnzen. Hierbij werden specifiek de helicasen UvrB en XPD van respectievelijk prokaryotische en eukaryote NER bestudeerd. Deze helicasen vereisen een ongeparkeerde regio in deDNA (een DNA-bubble) om op een van de twee DNA-enkele strengen te treden en vervolgens te verplaatsen langs deze streng, die door ATP-hydrolyse wordt aangevuurd. Naast de DNA-laesies werd derhalve een DNA-bubble geïntroduceerd in de substraten die fungeren als laadplaats voor de eiwitten.
De werkwijze voor de bereiding van specifieke lesion-DNA-substraten is eerder beschreven 11 . Het vereist een cirkelvormig DNA-construct (plasmide) met twee dicht gespannen restrictieplaatsen voor een nickase. In het kader van deze studie werd het plasmide pUC19N (2729 bp) gebruikt (gecreëerd door S. Wilson's laboratorium, NIEHS). Dit plasmide bevat drie nauw gespecificeerde restrictieplaatsen voor de nickase Nt.BstNBI die een 48 nucleotide (nt) rek vormt. Na incubatie met de nickase kan de streep van ssDNA tussen deze plaatsen verwijderd en vervangen worden door een oligonucleotide dat elke doelstelling bevat. Na elke stap wordt complete enzymatische vertering getest via agarosegelelektroforese. Gesneden cirkelvormig DNA kan onderscheiden worden door zijn lagere elektroforetische mobiliteit in vergelijking met het oorspronkelijke supercoiled plasmide. Gapping van het DNA en vervanging van de verwijderde rek door het specifieke substraat oligonucleotide kan worden geëvalueerd via digestie met een restrictie-enzym dat het substraat uitsluitend binnen het gebied tussen de nicks inciseert. Linearisatie van het cirkelvormige plasmide door het enzym zal derhalve worden onderdrukt voor het gapped DNA en hersteld na insertie van het specifieke oligonucleotide. Tenslotte maken twee endonuclease restrictieplaatsen (ideaal single cutters) de mogelijkheid tot het genereren van een lineair DNA-substraat, met de gewenste lengte en met de specifieke doelplaats in een gedefinieerde positie, evenals een DNA-bubble op een afstand van de laesie, ook in 5 'Of 3' richting.
Erkenning van de laesies door de NER helicases kan worden onderzocht via AFM beeldvorming. Verstoppelde DNA-translocatie van de helicasen bij tZijn lesion site is zichtbaar als een piek in de eiwit positie verdeling op het DNA en geeft aan dat er lesie herkenning is. Omdat DNA-translocatie van deze helicasen verder gericht is, met 5'-tot-3'-polariteit, geeft de afhankelijkheid van laesieherkenning op de positie van de laadplaats (DNA-bubbel stroomopwaarts of stroomafwaarts van de laesie) ook aan of de lesion bij voorkeur herkend wordt Op de getransloceerde of op de tegenovergestelde, niet-getranslodeerde ssDNA-streng 5 , 9 . In de volgende paragrafen worden de gebruikte methoden ingevoerd en worden de belangrijkste bevindingen van deze experimenten kort besproken. Belangrijk, analoog aan het voorbeeldige werk op DNA-reparatie hier getoond, kan AFM beeldvorming worden toegepast op de studie van verschillende DNA-interactie systemen, zoals DNA replicatie of transcriptie 8 , 12 , 13 , 14 </sup>.
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM statistische analyses van bindende posities van eiwitten op lange DNA-fragmenten die specifieke doelstellingsplaatsen bevatten, kunnen interessante details aantonen over de specifieke strategieën die door het eiwit gebruikt worden om deze sites 2 , 3 , 4 , 5 , 6 te herkennen. Om de resulterende positieverdelingen te interpreteren, moeten de posities van …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PUC19N, CPD-bevattende oligonucleotiden en p44 werden vriendelijk verschaft door respectievelijk Samuel Wilson, Korbinian Heil en Thomas Carell, en Gudrun Michels en Caroline Kisker. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 en TE-671/4 naar IT.
Materials
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computer |
| ThermoMixer and 1.5 ml block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 ml tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
| Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
| TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
| ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
| Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
| Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
| Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
| nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
| agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
| ATPƔS | Jena Bioscience | NU-406 | nucleotides |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
| oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
| oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
| oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
| SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |
Riferimenti
- Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
- Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
- Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
- Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
- Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
- Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
- Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
- Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochimica. 51, 1500-1509 (2012).
- Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
- Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
- Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
- Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
- Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
- Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
- Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, (2012).
- Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
- Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
- Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
- Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
- Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
- Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
- Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
- Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
- Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
- Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
- Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
- Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).
