Microscopia a forza atomica Ricerche del riconoscimento delle lesioni del DNA nella riparazione di excisione dei nucleotidi
Summary
Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.
Abstract
AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.
Introduction
La microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica potente per l'analisi delle interazioni proteine-DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Richiede solo basse quantità di materiale di campionamento per visualizzare direttamente campioni eterogenei con una risoluzione a livello di singola molecola. L'eterogeneità può derivare da diversi stati conformazionali o oligomerici di una proteina. In particolare, nel contesto di campioni di proteine-DNA, i complessi proteici possono mostrare diverse stoichiometrie e / o conformazioni indotte dal legame del DNA in generale o che si legano ad un sito target specifico all'interno del DNA. I campioni eterogenei possono anche contenere due (o più) diversi tipi di proteine e diversi complessi proteiciForme ( ad esempio , costituite da un solo tipo di proteine contro complessi eteromerici) possono interagire in modo diverso con il DNA. Gli studi qui discussi sfruttano l'imaging AFM in aria su campioni statici e secchi di proteine di riparazione del DNA legate a lunghi frammenti di DNA (~ 900 base paia, bp) che contengono una lesione che rappresenta un obiettivo di queste proteine. L'elevata risoluzione molecolare di AFM consente di distinguere tra diversi tipi di complessi proteici e di determinare le posizioni di legame delle proteine sui frammenti del DNA. Importante, le lesioni vengono introdotte nei substrati del DNA a posizioni ben definite. Poiché la posizione del sito di lesione nel DNA è nota, le distribuzioni di proteine legate al DNA forniscono una visione delle proprietà di riconoscimento delle diverse lesioni (differenti) dei complessi proteici (diversi), ad esempio , quanto bene riconoscono un particolare tipo di lesione A DNA non danneggiato) 2 , 3 , <supClass = "xref"> 4 , 5 , 6 . Le loro posizioni sul DNA permettono anche la distinzione tra i complessi proteici legati specificamente alle lesioni e ai complessi legati in modo non specifico altrove sul DNA. La caratterizzazione separata di questi diversi tipi complessi (complessi legati specificamente al complesso lesionario o non specifico) possono rivelare potenziali variazioni conformazionali nei complessi indotti dall'identificazione del sito di destinazione.
Le proteine di riparazione del DNA concentrate qui sono le elicasi che sono responsabili del riconoscimento delle lesioni nel percorso di riparazione delle escisioni del nucleotide (NER). Nei batteri, il NER è ottenuto dalle proteine UvrA, UvrB e UvrC. UvrA è responsabile della rilevazione iniziale delle lesioni in un complesso di scansione DNA di UvaA 2 / UvrB 2 . Alla verifica della lesione da UvrB questo complesso si converte in UvrB monomerico legato al sito della lesione e questo complesso specifico può quindi reclutare la pRocaryotic NER endonucleasi UvrC. UvrC eccisce un breve tratto (12-13 nt) di DNA a singolo filamento (ssDNA) contenente la lesione. Il tratto mancante viene poi riempito dalla DNA polimerasi. Infine, la ligasi DNA sigilla il tratto appena sintetizzato con il DNA originale 9 , 10 . Negli eucarioti, la maggior parte delle proteine della cascata NER fa parte del complesso multimerico di trascrizione II H (TFIIH). Dopo la rilevazione iniziale della lesione attraverso il complesso trimerico CEN2-XPC-HR23B, TFIIH viene reclutato nel sito di destinazione del DNA. Quando XPD all'interno del complesso verifica la presenza di una lesione target NER, le endonucleasi eerichee NER XPG e XPF vengono reclutate per accusare un breve tratto (24-32 nt) di ssDNA contenente la lesione 9 , 10 . Qui, in particolare, sono state studiate le elicasi UvrB e XPD da NER prokaryotico e eucariotico. Queste elicasi richiedono una regione non distinta nellaDNA (una bolla del DNA) per filettare su uno dei due singoli filamenti del DNA e successivamente traslocare lungo questa fili alimentata da idrolisi ATP. Oltre alle lesioni del DNA, una bolla del DNA è stata quindi introdotta nei substrati che funge da luogo di caricamento per le proteine.
La procedura per la preparazione di substrati specifici del DNA della lesione è stata descritta in precedenza 11 . Richiede un costrutto circolare del DNA (plasmide) con due siti di restrizione strettamente distanziati per un nickase. Nel contesto di questo studio è stato utilizzato il plasmide pUC19N (2729 bp) (creato dal laboratorio di S. Wilson, NIEHS). Questo plasmide contiene tre siti di restrizione strettamente distanziati per la nickel Nt.BstNBI che costituiscono un tratto di 48 nucleotidi (nt). Dopo l'incubazione con il nickase, il tratto di ssDNA tra questi siti può essere rimosso e sostituito da un oligonucleotide contenente qualsiasi caratteristica di destinazione. Dopo ogni passaggio, la digestione enzimatica completa viene testata mediante gel agarosioelettroforesi. Il DNA circolare nichelato può essere distinto a causa della sua minore mobilità elettroforetica rispetto al plasmide originale supercoiled. Lo scorrimento del DNA e la sostituzione del tratto rimosso con l'oligonucleotide specifico del substrato possono essere valutati tramite la digestione con un enzima di restrizione che incide il substrato esclusivamente all'interno della regione tra i nicchie. La linearizzazione del plasmide circolare da parte dell'enzima verrà quindi soppressa per il DNA scompattato e ripristinato dopo l'inserimento del oligonucleotide specifico. Infine, due siti di restrizione endonucleasi (idealmente taglienti singoli) consentono la generazione di un substrato lineare del DNA, con lunghezza come desiderato e con il sito target specifico in una posizione definita, nonché una bolla del DNA a distanza dalla lesione in 5 'O 3' direzione.
Il riconoscimento delle lesioni da parte delle elicasi NER può essere studiato tramite l' imaging AFM. La traslocazione del DNA degli alligati a tIl sito della lesione è visibile come un picco nella distribuzione della posizione proteica sul DNA e indica il riconoscimento della lesione. Poiché la traslocazione del DNA di queste elicasi è inoltre direzionale, con polarità 5'-3 ', la dipendenza del riconoscimento della lesione sulla posizione del sito di carico (bolla del DNA a monte oa valle della lesione) indica anche se la lesione è preferenzialmente riconosciuta Sullo strato ssDNA traslocato o al contrario, non traslocato , 5 , 9 . Nelle sezioni seguenti vengono introdotti i metodi utilizzati e saranno discussi brevemente i principali risultati di questi esperimenti. Importante, analogo al lavoro esemplare sulla riparazione del DNA mostrato qui, l'imaging AFM può essere applicato allo studio di diversi sistemi interattivi del DNA, come la replicazione del DNA o la trascrizione 8 , 12 , 13 , 14 </sup>.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analisi statistiche AFM di posizioni di legame di proteine su lunghi frammenti di DNA che contengono siti target specifici possono rivelare dettagli interessanti sulle strategie particolari impiegate dalla proteina per riconoscere questi siti 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Per interpretare le distribuzioni di posizione risultanti, le posizioni degli obiettivi nel …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PUC19N, oligonucleotidi contenenti CPD e p44 sono stati gentilmente forniti da Samuel Wilson, Korbinian Heil e Thomas Carell, e rispettivamente da Gudrun Michels e Caroline Kisker. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 e TE-671/4 a IT.
Materials
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computer |
| ThermoMixer and 1.5 ml block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 ml tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
| Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
| TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
| ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
| Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
| Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
| Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
| nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
| agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
| ATPƔS | Jena Bioscience | NU-406 | nucleotides |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
| oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
| oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
| oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
| SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |
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