Rilevamento dell'espressione di microRNA nella membrana peritoneale dei ratti usando il quantitativo PCR in tempo reale
Summary
Qui presentiamo un protocollo per la rilevazione dell'espressione di microRNA nella membrana peritoneale del ratto utilizzando la reazione a catena di polimerasi reattiva-trasversale in tempo reale. Questo metodo è adatto allo studio del profilo di espressione di microRNA nella membrana peritoneale del ratto in diverse condizioni patologiche.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sono piccoli RNA non codificanti che regolano l'espressione di RNA messaggero post-trascrizionale. Il profilo di espressione miRNA è stato studiato in vari organi e tessuti nel ratto. Tuttavia, i metodi standard per la purificazione di miRNA e l'individuazione della loro espressione nella membrana peritoneale del ratto non sono stati ben stabiliti. Abbiamo sviluppato un metodo efficace e affidabile per purificare e quantificare i miRNA utilizzando la reazione a catena di polimerasi a reazione inversa in tempo reale (qRT-PCR) nella membrana peritoneale del ratto. Questo protocollo è costituito da quattro fasi: 1) purificazione del campione di membrana peritoneale; 2) la purificazione di RNA totale incluso miRNA dal campione di membrana peritoneale; 3) trascrizione inversa di miRNA per produrre cDNA; E 4) qRT-PCR per rilevare l'espressione di miRNA. Usando questo protocollo, abbiamo determinato con successo che l'espressione di sei miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 e miRNA-34a-5p)Significativamente nella membrana peritoneale di un modello di fibrosi peritoneale del ratto rispetto a quelli nei gruppi di controllo. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare il profilo dell'espressione di miRNA nella membrana peritoneale dei ratti in molte condizioni patologiche.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) sono brevi e non codificanti RNA che regolano post-trascrizionale l'espressione del messaggero RNA (mRNA) 1 . I cambiamenti nell'espressione dei miRNA regolano l'espressione di molti mRNA che svolgono ruoli chiave in varie condizioni patologiche, tra cui il cancro, l'infiammazione, i disturbi metabolici e la fibrosi 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Pertanto, i miRNA hanno potenziale come nuovi biomarcatori e target terapeutici 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Il profilo di espressione miRNA è stato determinato in vari rattiOrgani e tessuti, compreso il fegato, il cuore, il polmone e il rene 9 . Tuttavia, i metodi standard per la purificazione e la rilevazione di miRNA nella membrana peritoneale del ratto non sono stati ben stabiliti.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di purificare e rilevare con successo miRNA nella membrana peritoneale del ratto. In primo luogo, il campione della membrana peritoneale è stato omogeneizzato utilizzando un omogeneizzatore di vetro, seguito dall'esposizione a un sistema di frantumazione biopolimero in una colonna di spin di microcentrifuga 10 . Successivamente, il RNA totale compreso il miRNA è stato purificato dal campione della membrana peritoneale usando una colonna di spin 10 a base di silice-membrane. Successivamente, il cDNA è stato sintetizzato dal RNA totale purificato utilizzando reverse transcriptase, polimerasi di poli (A) e primer oligo-dT 11 . Infine, l'espressione del miRNA è stata determinata da qRT-PCR usando un colorante intercalante 11 . La logica di questo protocollo è bIn precedenti studi che hanno dimostrato una significativa purificazione e rilevazione del miRNA nei tessuti mediante un semplice processo 8 , 10 , 11 . È stato riferito che l'uso di un sistema di frantumazione biopolimero in una colonna di centrifuga a microcentrifuga e colonna di spin a base di silicio-membrana può purificare l'RNA totale di alta qualità dai tessuti 10 . Il metodo di sintetizzare il cDNA da RNA totale purificato utilizzando transcriptasi inversa, polimerasi poli (A) e primer oligo-dT e il metodo di rilevamento dell'espressione di miRNA mediante qRT-PCR usando il colorante intercalante in questo protocollo sono stati riportati per dimostrare un'elevata precisione e Sensibilità 11 . Inoltre, questo è un processo semplice, che consente di risparmiare tempo e di evitare errori tecnici. Pertanto, questo protocollo è utile in studi che richiedono una rilevazione altamente accurata e sensibile del miRNA nella membrana peritoneale del ratto in una vasta gamma di condizioni patologiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando il protocollo presentato in questo manoscritto, miRNAs nella membrana peritoneale del ratto sono state correttamente purificate e rilevate usando qRT-PCR. L'affidabilità dell'analisi dei dati qRT-PCR dipende dalla qualità dei miRNA purificati. Pertanto, la purezza dei miRNAs può essere controllata prima di qRT-PCR dal rapporto di assorbanza a 260 nm a quella a 280 nm, che può essere misurato usando uno spettrofotometro. Quando non si può ottenere amplificazione significativa di miRNA utilizzando…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Miyako Shigeta per il suo ottimo supporto tecnico. Questo lavoro è stato parzialmente supportato da JSPS KAKENHI (numero di sovvenzione 25461252).
Materials
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
Riferimenti
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