zebrafish In Situ Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Summary

Questo manoscritto descrive i metodi per le registrazioni elettrofisiologiche da neuroni spinali di embrioni di zebrafish e larve. La preparazione mantiene neuroni in situ e spesso comporta la dissezione minimo. Questi metodi consentono lo studio elettrofisiologico di una varietà di neuroni spinali, dalla acquisizione iniziale eccitabilità elettrica attraverso le prime fasi larvali.

Abstract

Zebrafish, introdotto come modello di sviluppo, hanno guadagnato popolarità in molti altri campi. La facilità di allevamento gran numero di organismi rapido sviluppo, combinata con la chiarezza ottica embrionale, servito come attributi convincenti iniziali di questo modello. Nel corso degli ultimi due decenni, il successo di questo modello è stato ulteriormente spinto dalla sua riconducibilità agli schermi di mutagenesi su larga scala e dalla facilità di transgenesi. Più di recente, gene-editing approcci hanno esteso la potenza del modello.

Per gli studi neurologico, zebrafish e larva forniscono un modello a cui possono essere applicati diversi metodi. Qui, ci concentriamo sui metodi che consentono lo studio di una proprietà essenziale dei neuroni, eccitabilità elettrica. La nostra preparazione per lo studio elettrofisiologico dei neuroni spinali zebrafish implica l'uso di colla veterinario sutura per fissare la preparazione ad una camera di registrazione. Metodi alternativi per la registrazioneda embrioni zebrafish e larve comportare l'attacco della preparazione per la camera con un perno multa tungsteno ^{1, 2, 3, 4, 5.} Un perno di tungsteno è più spesso utilizzato per montare il preparato in un orientamento laterale, anche se è stato utilizzato per montare larve dorsale rivolta verso l'alto ^4. La colla sutura è stato utilizzato per montare embrioni e larve in entrambi gli orientamenti. Utilizzando la colla, una dissezione minima può essere eseguita, consentendo l'accesso ai neuroni spinali senza l'uso di un trattamento enzimatico, evitando così ogni danno risultante. Tuttavia, per le larve, è necessario applicare un trattamento enzimatico breve per rimuovere il tessuto muscolare che circonda il midollo spinale. I metodi descritti qui sono stati utilizzati per studiare le proprietà elettriche intrinseche dei neuroni motori, interneuroni e neuroni sensoriali in diversi Sviluppo deil stadi ^{6, 7, 8, 9.}

Introduction

George Streisinger aperto la strada all'uso di Danio rerio, comunemente noto come pesce zebra, come sistema modello per l'analisi genetica di sviluppo dei vertebrati ^10. Il modello offre diversi vantaggi tra cui: (1) relativamente semplice e poco costoso zootecnia; (2) fecondazione esterna, consente un facile accesso alle embrioni dalle prime fasi di sviluppo; e (3) un embrione trasparente, permettendo osservazioni dirette e ripetute di cellule, tessuti e organi in quanto costituiscono.

Nel corso dei decenni successivi, numerosi miglioramenti aumentato ulteriormente la potenza del modello di ....

Protocol

Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC; Ufficio di laboratorio Risorse Animali, Università del Colorado Anschutz Medical Campus).

1. Zebrafish Zootecnica

1. Sollevare e mantenere adulto zebrafish (Danio rerio) a 28,5 ° C in un / 14 h ciclo luce 10 h scuro e con apposito trattamento dell'acqua e scambio ^52.
2. Sollevare zebrafish embrioni / larve a 28,5 ° C in terreno di embrione fino a raggiungere la fase desiderata (ad esempio, 2 dpf).

2. Preparazione di dissezione Materiali

Results

Noi abbiamo registrato con successo da neuroni ROHON-barba in 17 HPF embrioni a 7 dpf larve (Figura 5A e 5B). Quando sono stati registrati cellule ROHON-barba, la preparazione è stata montata dorsale rivolta verso l'alto. Tale montaggio consente l'identificazione univoca delle cellule ROHON-barba basati sulle loro posizioni dorsali superficiali e grandi dimensioni soma. L'identificazione è ulteriormente confermata dal potenziale di membrana a riposo hype.......

Discussion

I metodi qui descritti consentono la caratterizzazione elettrica e morfologica dei neuroni sensoriali e motori di embrioni zebrafish dopo minima dissezione del midollo spinale. Neuroni restano sani per almeno 1 h, il limite di tempo imposto su queste registrazioni. I neuroni sono stati registrati utilizzando la configurazione a cellula intera serie, così come da patch nucleate; quest'ultimo metodo minimizza problemi di spazio-clamp che può precludere uno studio biofisico dettagliato delle correnti ioniche

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtro sottovuoto/Flacone di stoccaggio, pori da 0,22 mm	Corning	431096
Filtro per siringa 0,2 mm	Whatman	6780-2502
Tricaina	Sigma	A-5040	Etile 3-amminobenzoato metansolfonato sale
&alfa;-bugarotossina	Tocris	11032-79-4
Tetrodotossina	Tocris	4368-28-9
Alexa-549 sale di idrazina	Sonde molecolari	A-10438	colorante fluorescente
Filtro per provette da centrifuga Spin-X	Corning	8161
Vetrino per microscopio	Fisher	12-550C
Sylgard silicone kit di elastomeri	Dow Corning	184	elastomero siliconico
piastre di Petri	Falcon	351029
capillari in vetro borosilicato	Harvard Apparatus	30-0038	diametri interni ed esterni di 0,78 e 1,0 mm (capillari in vetro a parete sottile)
Capillari in vetro borosilicato	Drummond Scientific	1-000-1000-100	diametri interni ed esterni di 1,13 e 1,55 mm (capillari in vetro a pareti spesse)
Raccordo miniaturizzato in polipropilene spinato	Cole-Palmer	6365-90
Adesivo per tessuti Vetbond	3M	1469SB
Collagenase XI	Sigma	C7657
Estrattore per microelettrodi	Sutter Instruments	Modello P-97
Dispositivi	molecolari	Axopatch 200B
Dispositivi molecolari	per stadio di testa	CV203BU
Micromanipolatore motorizzato	Sutter Instruments	MP-285
Tygon tubo	Fisher	14-169-1B	ID 1/16 IN, OD 1/8 IN e WALL 1/32 IN (tubo flessibile da laboratorio)
Portaelettrodo	Molecular Devices	1-HC-U
Pharmaseal Rubinetti a tre vie	Baxter	K75
Digitalizzatore	Axon Instruments	Digidata 1440A
Microscopio invertito	Zeiss	Axioskop2 FS plus
40X/0.80W Obiettivo Achroplan	Software di
	Axon Instruments		PClamp 10 - Clampex e Clampfit
Estrattore per micropipette	Sutter Instruments	Modello P-97
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Soluzioni di dissezione e registrazione (in mM)
Tutte le soluzioni, ad eccezione di quella intracellulare, sono stabili per ~2-3 mesi se filtrate (coppe filtranti da 0,22 mm) e conservate a temperatura ambiente (RT).
La soluzione intracellulare viene filtrata (filtri per siringhe da 0,2 mm) e conservata congelata (-20 ° C) in piccole aliquote che vengono scongelate singolarmente il giorno dell'uso.
dissezione/suoneria'			145 NaCl, 3 KCl, 1,8 CaCl2,2H2O, 10 HEPES; pH 7,4 (con NaOH)
Pipetta (intracellulare) soluzione			135 KCl, 10 EGTA-acido, 10 HEPES; pH 7,4 (con KOH).
Soluzione di registrazione a bagno (extracellulare)/pinza amperometrica			125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (con NaOH).
Soluzione madre di sale di idrazina Alexa-594.			Preparare un stock da 13,2 mM in ddH2O, aliquota (~100 µ l) e conservare a -20 °C. Per l'uso, diluire la soluzione madre 132 volte con la soluzione pipettata fino a una concentrazione finale di 100 mM. Dopo la diluizione, filtrare la soluzione per pipette contenente Alexa-594. con un filtro a provetta da centrifuga.
Name	Azienda	Numero catalogo	Comments
Agenti immobilizzanti
0,4% sale di etil 3-amminobenzoato metansulfonato (Tricaina)			Preparare una soluzione madre allo 0,4% in 0,2 M Tris, pH 9 (0,4 g Tricaina/100 mL 0,2 M Tris
Regola il pH a 7 con NaOH e conserva a -20 °C.
Per l'uso, diluire la soluzione madre ~25 volte in terreno embrionale
250 mM &alfa;-bungarotossina			Preparare un stock da 250 mM in ddH2O (1 mg/500 mL), preparare 100 µ L aliquote, e sotre a -20 °C.
Per l'uso, diluire 2.500 volte con soluzione extracellulare fino a una concentrazione finale di 100 nM.
1 mM di tetrodotossina			Preparare un stock da 1 mM in ddH2O (1 mg/3 mL), preparare 100 µ L aliquote, e sotre a -20 °C.
Per l'uso, diluire 2.000 volte con una soluzione extracellulare fino a una concentrazione finale di 500 nM.