Protocollen voor het visualiseren steroidogenic organen en hun Interactive Organen met Immunokleuring in de fruitvlieg<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
We beschrijven een protocol voor dissectie, fixatie en immunokleuring van steroidogenic organen in Drosophila larven en volwassen vrouwtjes steroïde hormonen biosynthese en haar reguleringsmechanisme bestuderen. Naast steroïdogene organen visualiseren we de innervatie van steroidogenic organen en steroidogene doelcellen zoals kiemlijn stamcellen.
Abstract
In meercellige organismen, wordt een kleine groep cellen begiftigd met een gespecialiseerde functie in hun biogene activiteit induceren van een systemische reactie op groei en reproductie. In insecten, het larvale prothoracale klier (PG) en de volwassen vrouwelijke eierstok spelen een essentiële rol in de biosynthese van de belangrijkste steroïde hormonen genaamd ecdysteroïden. Deze ecdysteroidogenic organen geïnnerveerd door het zenuwstelsel, waar de timing van biosynthese wordt beïnvloed door omgevingsfactoren. Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren ecdysteroidogenic organen en hun interactieve organen in larven en volwassenen van de fruitvlieg Drosophila melanogaster, die een geschikt model voor het bestuderen steroïde hormonen biosynthese en haar reguleringsmechanisme biedt. Bekwame dissectie laat ons toe om de posities van ecdysteroidogenic organen en hun interactieve organen, inclusief de hersenen, de ventrale zenuw koord, en andere weefsels te behouden. Immunokleuring met eenntibodies tegen ecdysteroidogenic enzymen, naast transgene fluorescentie eiwitten aangestuurd door weefselspecifieke promoters zijn beschikbaar voor ecdysteroidogenic cellen te merken. Bovendien is de innervatie van de ecdysteroidogenic organen kan ook worden gelabeld met specifieke antilichamen of een verzameling van GAL4 drivers in verschillende soorten neuronen. Daarom kan de ecdysteroidogenic organen en hun neuronale verbindingen tegelijkertijd worden gevisualiseerd door immunokleuring en transgene technieken. Tot slot beschrijven we hoe kiemlijn stamcellen, waarvan de proliferatie en onderhoud worden gecontroleerd door ecdysteroïden te visualiseren. Deze methode draagt bij aan beter begrip van steroïde hormonen biosynthese en de neuronale reguleringsmechanisme.
Introduction
In meercellige organismen, is een groep cellen begiftigd met een gespecialiseerde functie in hun biogene activiteit die essentieel is voor het hele lichaam. Hun taken te vervullen, elk weefsel of orgaan tot expressie brengt een reeks van genen betrokken bij hun functies en communiceert met andere weefsels hun activiteiten in het kader van de ontwikkeling orkestreren. Om dergelijke gespecialiseerde celfuncties en inter-orgaan interacties te karakteriseren, moeten we een groep cellen specificeren bij andere typen cellen die in de meercellige architectuur intact.
Een voorbeeld van dergelijke speciale organen een steroïdogene orgaan, waar veel biosynthetische enzymen mediëren de omzetting stappen uit cholesterol actieve steroïde hormonen 1. De meeste van deze enzymen genen specifiek tot expressie in steroïdogene organen en de biosyntheseroute wordt strak gereguleerd door verschillende externe stimuli via humorale ingangen en neuronale ingangen. Een keergesynthetiseerd, steroïde hormonen worden uitgescheiden in de hemolymfe en zijn gericht op vele weefsels en organen voor het reguleren van de expressie van diverse genen 2. Derhalve is de werking van een steroïdhormoon induceert een systemische reactie op homeostase, groei en voortplanting te behouden.
De functies van steroïdhormoon biosynthese en pleiotrope werkingen van steroïde hormonen te onderzoeken, kan Drosophila melanogaster worden gebruikt als een geschikt modelsysteem. Tijdens de larvale stadia, het insect steroïdhormoon, ecdysteroid wordt gebiosynthetiseerd in een gespecialiseerde endocrien orgaan genoemd prothoracale gland (PG) 3. In de PG verschillende ecdysteroidogenic enzymen specifiek katalyseren de omzetting meerdere stappen van cholesterol tot ecdyson, welke controles rui en metamorfose op het juiste ontwikkelingsstadia 4. Daarom wordt een dynamische verandering in ecdysteroid titer geregelddoor velen signaalwegen in reactie op omgevingsfactoren. Aan de andere kant, in het volwassen stadium, ecdysteroid speelt een essentiële rol in de fysiologie, met inbegrip van reproductie, slaap, het geheugen en de levensduur 5, 6, 7, 8. Het is bekend dat ecdysteroid actief gebiosynthetiseerd in de eierstok, reguleren de progressie van oogenesis 6, 7, 8, 9, 10, 11. Onlangs hebben we gemeld dat het aantal kiemlijn stamcellen (GSC) wordt beïnvloed door ecdysteroid en geslacht peptide signalering in respons op stimuli paring 12.
Krachtige instrumenten van D. melanogaster genetica en celbiologie, waaronder goed geannoteerde genoominformatie, binaire genexpressiesystemen en transgene RNAi technieken hebben het mogelijk om genen te identificeren essentiële biosynthese ecdysteroid de PG en eierstok 13, 14, 15. Zodra de ecdysteroidogenic genen zijn geïdentificeerd, kunnen de transcriptionele regulatie van deze genen en het dynamische lokalisaties van genproducten in de biosyntheseroute 16 onderzocht. Daartoe kwantitatieve reverse transcriptie-PCR, RNA in situ hybridisatie en immunohistologische analyse worden uitgevoerd. De toepassing van deze technieken is voorzien van een uitdagende taak; de uitgebreide dissectie van de PG of de eierstok. Met name de PG van de fruitvlieg relatief kleiner is dan die van andere insecten (zoals de zijderups en klap vliegen), dus moet oefenen de vitale vaardigheid van fruitvlieg dissectie voor bemonstering. Bovendien zijn zowel ecdysteroidogenic organen ontvangen innervaties van het centrale zenuwstelsel (CNS) 17, 18, 19, 20. Zo accurate anatomische analyse, de ecdysteroidogenic organen komen intact naast het centraal zenuwstelsel en andere organen, de neuronenverbindingen niet te verstoren gehouden.
Hier bieden we protocollen voor de dissectie en visualisatie van steroidogenic organen in D. melanogaster. Het leren van de dissectie techniek is het belangrijk uitgangspunt voor deze experimenten. Daarnaast kan men met succes het etiket van de steroidogenic organen evenals hun interactieve organen met een aantal antilichamen en GAL4 driver lijnen. Door gebruik te maken van deze technieken, materialen en genetica, kan men de uitgebreide mechanismen van steroïde hormoon biosynthese bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
We bestudeerden ecdysteroid biosynthese en haar reguleringsmechanisme in D. melanogaster, en bedacht een protocol voor dissectie en immunokleuring. De timing van ecdysteroïdrespons biosynthese wordt beïnvloed door omgevingsfactoren tot neuronale ingangen 33, dus is het essentieel om de innervatie van de organen ecdysteroidogenic houden met de hersenen, VNC en andere weefsels tijdens dissectie.
Zoals hierboven is beschreven, de D. melanogaster PG co…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Reiko Kise en Tomotsune Ameku voor hun technische ondersteuning voor dit werk. We zijn ook dankbaar voor Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, de Bloomington Drosophila Stock Center, KYOTO Stock Center (DGRC) en de Developmental Studies Hybridoma Bank voor aandelen en reagentia. Dit werk werd ondersteund door subsidies aan YSN van JSPS KAKENHI Grant Number 16K20945, The Naito Foundation, en Inoue Science Research Award; en door een subsidie aan RN uit MEXT KAKENHI Grant Number 16H04792.
Materials
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| Terumo syringe, 1ml | TERUMO | SS-01T | |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
Riferimenti
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
- Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
- Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
- Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
- Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
- Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
- Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetica. 154 (3), 1203-1211 (2000).
- Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
- Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
- Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
- Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O’Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
- Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O’Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
- Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
- Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
- Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
- Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
- Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
- Parvy, J. -. P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
- Li, H. -. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
- Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
- Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
- Song, X., Zhu, C. -. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
- Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
- Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
- Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
- Yamanaka, N., Marqués, G., O’Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).
