Protokolle für die Visualisierung Steroidogenic Organe und deren Interactive Organe mit Immunostaining in der Fruchtfliege<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Präparation, Fixierung und Immunfärbung von steroidogenen Organen in Drosophila – Larven und erwachsenen Frauen Steroidhormon – Biosynthese und ihren Regulationsmechanismus zu studieren. Neben steroidogenen Organe visualisieren wir die Innervation steroidogenen Organe sowie steroidogenen Zielzellen wie Keimbahn-Stammzellen.
Abstract
In mehrzelligen Organismen wird eine kleine Gruppe von Zellen mit einer spezialisierten Funktion in ihrer biogenen Aktivität ausgestattet ist, um eine systemische Reaktion auf Wachstum und Vermehrung zu induzieren. Bei den Insekten, die Larven Prothoraxdrüse (PG) und die erwachsenen weiblichen Ovar wesentliche Rollen spielen in die Biosynthese der Hauptsteroidhormone genannt ecdysteroids. Diese ecdysteroidogenic Organe werden aus dem Nervensystem innerviert, durch welche der Zeitpunkt der Biosynthese durch Umweltreize beeinflusst wird. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung ecdysteroidogenic Organe und deren interaktive Organe in Larven und Erwachsene der Fruchtfliege Drosophila melanogaster, die für das Studium Steroidhormon – Biosynthese und ihrer Regulationsmechanismus ein geeignetes Modellsystem zur Verfügung stellt. Geschickte Dissektion ermöglicht es uns, die Positionen der ecdysteroidogenic Organe und deren interaktive Organe einschließlich des Gehirns, der Bauchmark und andere Gewebe zu halten. Immunostaining mit einemntibodies gegen ecdysteroidogenic Enzyme, zusammen mit transgenen Fluoreszenzproteine durch gewebespezifische Promotoren angetrieben wird, stehen zur Verfügung ecdysteroidogenic Zellen zu markieren. Darüber hinaus kann die Innervation der ecdysteroidogenic Organe auch durch spezifische Antikörper oder eine Sammlung von GAL4-Treiber in verschiedenen Arten von Neuronen markiert werden. Daher können die ecdysteroidogenic Organe und die neuronale Verbindungen gleichzeitig durch Immunfärbung und transgene Techniken sichtbar gemacht werden. Schließlich beschreiben wir, wie Keimbahn-Stammzellen zu visualisieren, Proliferation und Wartung dessen werden durch ecdysteroids gesteuert. Dieses Verfahren trägt zum umfassenden Verständnis von Steroidhormon-Biosynthese und ihrem neuronalen Regulationsmechanismus.
Introduction
In mehrzelligen Organismen wird eine Gruppe von Zellen mit einer spezialisierten Funktion in ihrer biogenen Aktivität ausgestattet ist, die für den ganzen Körper wesentlich ist. Um ihre Aufgaben zu erfüllen, jedes Gewebe oder Organ zum Ausdruck bringt eine Reihe von Genen, die Funktionen im Zusammenhang und kommuniziert mit anderen Geweben, ihre Aktivitäten im Zusammenhang mit der Entwicklung orchestrieren. Um solche spezialisierten Zellfunktionen und Interorgan Wechselwirkungen zu charakterisieren, müssen wir zusammen mit anderen Arten von Zellen, die eine Gruppe von Zellen angeben, wobei in der vielzelligen Architektur intakt gehalten.
Ein Beispiel einer solchen spezialisierten Organe ist ein steroidogenen Organ, in dem viele Biosyntheseenzyme die Umwandlungsschritte von Cholesterin zu aktiven Steroidhormone 1 vermitteln. Die meisten dieser Gene werden in Enzym steroidogenen Organen spezifisch exprimiert wird, und die Biosyntheseweg wird eng durch viele äußere Reize über humorale Eingänge und neuronalen Eingänge geregelt. Einmalsynthetisiert, sind Steroidhormone , in die Hämolymphe sezerniert und werden in vielen Geweben und Organen gezielt für die Expression einer Vielzahl von Genen 2 zu regulieren. Daher induziert die Wirkung eines Steroidhormons eine systemische Reaktion Homöostase, Wachstum und Reproduktion zu erhalten.
Um die Funktionen von Steroidhormon – Biosynthese und die pleiotrope Wirkungen von Steroidhormonen, Drosophila melanogaster zu untersuchen kann als geeignetes Modellsystem verwendet werden. Während der Larvenstadien, das Insektensteroidhormon, Ecdysteroid, wird in einem spezialisierten endokrinen Organe biosynthetisiert genannt Prothoraxdrüse (PG) 3. In der PG, katalysieren ecdysteroidogenic mehr Enzyme spezifisch die mehrere Umwandlungsschritte von Cholesterin zu Ecdyson, die an den entsprechenden Entwicklungsstadien 4 Häutung und Metamorphose steuert. Daher wird eine dynamische Änderung der Ecdysteroid Titer geregeltviele Signalwege in Reaktion auf Umweltreize. Auf der anderen Seite, im Erwachsenenstadium spielt ecdysteroid wesentliche Rolle in der Physiologie, einschließlich der Reproduktion, Schlaf, Gedächtnis, und die Lebensdauer 5, 6, 7, 8. Es ist bekannt , dass Ecdysteroid aktiv im Ovar biosynthetisiert wird, um das Fortschreiten der Oogenese regulierende 6, 7, 8, 9, 10, 11. Vor kurzem haben wir berichtet , dass die Anzahl von Keimbahn – Stammzellen (GSCs) durch Ecdysteroid und Geschlecht Peptid Signalisierung in Reaktion auf Paarungs 12 Reize beeinflußt wird.
Mächtige Werkzeuge von D. melanogaster Genetik und Zellbiologie, einschließlich gut kommentierten Genominformationen, binary GenExpressionssysteme, und transgene RNAi – Techniken haben es uns ermöglicht , Gene wesentlich für Ecdysteroid – Biosynthese in der PG und Ovar 13, 14, 15 zu identifizieren. Sobald die ecdysteroidogenic Gene identifiziert werden, kann die Transkriptionsregulation dieser Gene und die dynamischen Lokalisierungen von Genprodukten in dem Biosyntheseweg 16 untersucht werden. Zu diesem Zweck quantitative reverse Transkription-PCR-RNA in situ Hybridisierung und immunhistologische Analysen durchgeführt. Die Anwendung dieser Techniken beinhaltet eine anspruchsvolle Aufgabe; Die aufwendige Präparation des PG oder des Ovars. Insbesondere relativ kleiner die PG des Fruchtfliege ist als die von anderen Insekten (zB die Seidenraupe und die Schmeißfliege), so muss man die lebenswichtige Fähigkeit der Fruchtfliege Präparation für die Probenahme üben. Darüber hinaus erhalten beide ecdysteroidogenic Organe Innervations aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) , 17, 18, 19, 20. So kann eine genaue anatomische Analysen sollten die ecdysteroidogenic Organe intakt zusammen mit dem ZNS und anderen Organen gehalten werden, nicht ihre neuronalen Verbindungen zu stören.
Hier bieten wir Protokolle für die Präparation und Visualisierung von steroidogenen Organe in D. melanogaster. die Dissektionstechnik Lernen ist der Schlüssel Ausgangspunkt für diese Experimente. Darüber hinaus kann man erfolgreich die steroidogenen Organe sowie deren interaktive Organe mit mehreren Antikörpern und GAL4 Treiberleitungen beschriften. Unter Ausnutzung dieser Techniken, Materialien und Genetik kann man die umfassenden Mechanismen der Steroidhormon-Biosynthese studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir studierten ecdysteroid Biosynthese und ihren Regulationsmechanismus in D. melanogaster, und ein Protokoll für die Präparation und Immunfärbung entwickelt. Der Zeitpunkt der Ecdysteroid – Biosynthese wird durch Umweltreize durch neuronale Eingänge 33, beeinflußt , so ist es wesentlich , die Innervation der ecdysteroidogenic Organe zusammen mit dem Gehirn, VNC und anderen Geweben während der Präparation zu erhalten.
Wie oben beschrieben, bildet die <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Reiko Kise und Tomotsune Ameku für ihre technische Unterstützung für diese Arbeit. Wir sind auch dankbar, dass Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Stock Center, KYOTO Stock Center (DGRC) und der Entwicklungsstudien Hybridoma Bank für Aktien und Reagenzien. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse zu YSN von JSPS KAKENHI Grantnummer 16K20945, The Naito-Stiftung und Inoue Wissenschaft Forschungspreis unterstützt; und durch einen Zuschuss zu RN von MEXT KAKENHI Grantnummer 16H04792.
Materials
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| Terumo syringe, 1ml | TERUMO | SS-01T | |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
Riferimenti
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