Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Biz diseksiyon, tespit ve steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmaya Drosophila larvaları ve yetişkin kadınlarda Sterpidojenik organların immün için bir protokol açıklar. steroidojenik organlara ek olarak, böyle germ çizgili kök hücreleri gibi steroidojenik organların innervasyon olarak steroidojenik hedef hücreleri görselleştirmek.
Abstract
Çok hücreli organizmalarda, hücre küçük bir grup, büyüme ve üreme sistemik tepkisine sebep olarak, bunların biyojenik aktiviteye özel bir fonksiyon ile donatılmıştır. böceklerde, larva prothoracic bezi (PG) ve ekdisteoidlerden adlandırılan ana steroid hormonları-üreten mutantı ya yetişkin kadın yumurtalık oyun temel roller. Bu ecdysteroidogenic organlar biyosentezi zamanlaması çevresel işaret tarafından etkilendiğini sinir sistemi, gelen innerve. Burada steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmak için uygun bir model sistemi sağlar Drosophila melanogaster, sinek ecdysteroidogenic organları ve larva kendi interaktif organları ve meyve yetişkinleri görselleştirilmesi için bir protokol açıklar. Usta diseksiyon bize beynin ventral sinir kordonu ve diğer dokularda da dahil ecdysteroidogenic organların konumlarını ve interaktif organlarını korumak sağlar. Bir ile immün boyamaecdysteroidogenic enzimlerine karşı ntibodies, dokuya özel promoterler tarafından tahrik edilen transgenik floresan proteinleri ile birlikte, ecdysteroidogenic hücreleri etiketlemek için kullanılabilir. Üstelik ecdysteroidogenic organların inervasyonları da spesifik antikorların veya nöronların çeşitli GAL4 sürücülerin bir koleksiyon ile etiketli olabilir. Bu nedenle, ecdysteroidogenic organları ve nöronal bağlantıları immün ve transgenik teknikler ile eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Son olarak, kimin çoğalması ve bakım ekdisteoidlerden tarafından kontrol edilir germ hattı kök hücreleri, görselleştirmek için nasıl açıklar. Bu yöntem steroid hormon biyosentezi ve nöronal düzenleyici mekanizmanın kapsamlı anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
Introduction
çok hücreli organizmalarda, bir grup hücre tüm vücut için gerekli olan kendi biyojenik aktivitesinde özel fonksiyonu ile donatılmıştır. görevlerini yerine getirmek için, her bir doku ya da organ işlevleri ile ilişkili genlerin bir dizi ifade eden ve gelişme bağlamında kendi faaliyetlerinin düzenlemek için başka doku ile iletişim kurar. Böyle özel hücresel fonksiyonları ve arası Organ etkileşimlerini karakterize etmek için, hücrelerin diğer türleri çok hücreli mimarisinde bozulmadan tutuluyor ile birlikte bir hücre grubu belirtmek gerekir.
Gibi özel organların bir örneği birçok biyosentetik enzimleri aktif steroid hormonları 1 kolesterolden dönüşüm basamaklarını aracılık bir steroidojenik organdır. Bu enzim genlerinin çoğu özel olarak steroidojenik organlarda eksprese edilir ve biyosentez yolu sıkıca hümoral giriş ve nöronal girişleri yoluyla çok sayıda dış uyaranlarla düzenlenir. bir Zamanlarsentez, steroid hormonlar hemolimf içine salgılanır ve gen 2, çeşitli ekspresyonunun düzenlenmesi için bir çok doku ve organların hedeflenir. Bu nedenle, bir steroid hormonunun hareketini homeostazı, büyüme ve üreme korumak için sistemik bir yanıtı indükler.
Steroid hormon biyosentezindeki fonksiyonlarını ve steroid hormon pleiotropik etkilerin araştırılması için, Drosophila melanogaster, uygun bir model sistem olarak da kullanılabilir. Larva aşamalarında, böcek steroid hormonu, ekdisteroid, özel bir endokrin organa biyosentezlenir prothoracic bezi (PG) 3 çağırdı. PG, çeşitli ecdysteroidogenic enzimler, özel olarak uygun bir gelişim aşamalarında 4 de deri değiştirme ve başkalaşım kontrol eden, ekdison kolesterol birden fazla dönüşüm basamaklarını katalize ederler. Bu nedenle, ekdisteroid titre içindeki dinamik değişim düzenlenirçevresel uyaranlara yanıt olarak birçok sinyal yollarının tarafından. Öte yandan, yetişkin safhasında, ekdisteroid üreme, uyku, hafıza ve ömrü 5, 6, 7, 8 dahil olmak üzere fizyolojisinde önemli rol oynar. Ekdisteroid aktif oogenez 6, 7, 8, 9, 10, 11 ilerlemesini düzenleyen, yumurtalık biyosentezlenmiş olduğu bilinmektedir. Yakın zamanda tohum çizgisi kök hücreleri (GSC'ler) sayısı çiftleşme yanıt olarak ekdisteroid ve cinsiyete peptid sinyal etkilenir bildirmiştir 12 uyarıcıya sahip.
D. güçlü araçlar iyi açıklamalı genom bilgileri de dahil olmak genetik ve hücre biyolojisi, melanogaster, ikili gensentezleme sistemleri ve transgenik RNAi teknikleri, PG ve yumurtalık 13, 14, 15'te biyosentezini ekdisteroid için gerekli genleri tanımlamak için sağlamıştır. Ecdysteroidogenic genler tespit edildikten sonra, bu genlerin ve gen ürünlerinin dinamik lokalizasyonunun transkripsiyonel düzenleme biyosentez yolunun 16 incelenebilir. Bu amaç için, nicel-ters transkripsiyon-PCR, in situ hibridizasyon ve immünohistolojik analizi RNA yürütülmektedir. Bu tekniklerin uygulanması zor bir görev içerir; PG veya yumurtalık ayrıntılı diseksiyon. Özellikle meyve sineği PG diğer böcekler bu göreceli olarak daha küçük olan (örneğin ipek böceği ve darbe sineği), bu nedenle bir meyve hayati bir beceri örnekleme için diseksiyon sinek uygulama gerekir. Ayrıca, her iki ecdysteroidogenic organlar innervasyon almakMerkezi sinir sisteminde (MSS) 17, 18, 19, 20 s. Bu nedenle, doğru anatomik analizler için, ecdysteroidogenic organlar CNS ve diğer organlarda, bunların nöronal bağlantıları bozmak için birlikte sağlam tutulmalıdır.
Burada diseksiyon ve D Sterpidojenik organların görüntülenmesi için protokoller sağlamaktadır. melanogaster. diseksiyon tekniğini öğrenmek bu deneyler için anahtar bir başlangıç noktasıdır. Buna ek olarak, bir başarıyla birkaç antikorlar ve GAL4 sürücü hatları ile steroidogenik organları yanı sıra interaktif organları etiketleyebilirsiniz. bu teknikler, malzeme ve genetik yararlanarak, bir steroid hormon biyosentezindeki kapsamlı mekanizmaları incelemek için.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz ekdisteroid biyosentezi ve D. melanogaster düzenleyici mekanizma inceledi ve diseksiyon ve immün için bir protokol geliştirmiştir. Ekdisteroid biyosentezi zamanlaması nöronal girişler 33 boyunca çevresel olaylara etkilenir, nedenle diseksiyon sırasında beyin, VNC ve diğer dokuları ile birlikte ecdysteroidogenic organların innervasyon korumak için esastır.
Yukarıda tarif edildiği gibi, D. melanogaster PG korpus allata (C…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu iş için kendi teknik destek için Reiko Kise ve Tomotsune Ameku teşekkür ederim. Ayrıca Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Stok Merkezi, KYOTO Stok Merkezi (DGRC) ve hisse senedi ve reaktifler için Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası minnettarız. Bu çalışma JSPS KAKENHI Grant Numarası 16K20945, Naito Vakfı ve Inoue Bilim Araştırma Ödülü dan ysn bağışları ile desteklenmiştir; ve mext KAKENHI Hibe Numarası 16H04792 dan RN bir hibe ile.
Materials
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| Terumo syringe, 1ml | TERUMO | SS-01T | |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
Riferimenti
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
- Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
- Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
- Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
- Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
- Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
- Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetica. 154 (3), 1203-1211 (2000).
- Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
- Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
- Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
- Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O’Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
- Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O’Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
- Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
- Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
- Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
- Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
- Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
- Parvy, J. -. P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
- Li, H. -. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
- Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
- Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
- Song, X., Zhu, C. -. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
- Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
- Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
- Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
- Yamanaka, N., Marqués, G., O’Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).
