कोलेजन प्रेरित एकत्रीकरण पर Pannexin1 संदमक में प्रभाव खूब ब्लू FCF: turbidimetry मानव पर प्लेटलेट्स धोया
Summary
हम मानव turbidimetry द्वारा एगोनिस्ट प्रेरित प्लेटलेट एकत्रीकरण माप के बाद खून से धोया प्लेटलेट्स की अलगाव के लिए एक सरल तरीका वर्णन करते हैं। एक उदाहरण के रूप में हम एकत्रीकरण Pannexin1 चैनल अवरोध करनेवाला खूब ब्लू FCF के साथ एक पूर्व ऊष्मायन के बाद कोलेजन के लिए मानव प्लेटलेट्स की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इस विधि लागू होते हैं।
Abstract
Turbidimetry एक प्रयोगशाला तकनीक है कि या तो प्लाज्मा (प्लेटलेट रिच प्लाज्मा, पीआरपी) में या (धोया प्लेटलेट्स) बफर में निलंबित कर दिया प्लेटलेट्स की एकत्रीकरण को मापने के लिए लागू किया जाता है, एक के उपयोग या एगोनिस्ट का एक संयोजन कर रहा है। उनके प्लाज्मा वातावरण से और थक्का-रोधी के अभाव में अलग धोया प्लेटलेट्स के उपयोग आंतरिक प्लेटलेट गुणों का अध्ययन के लिए अनुमति देता है। एगोनिस्ट, arachidonic एसिड (एए), एडेनोसाइन di-फॉस्फेट (ADP) की बड़ी पैनल के अलावा, थ्रोम्बिन और कोलेजन सर्वाधिक उपयोग होने वाले हैं। एकत्रीकरण प्रतिक्रिया निरंतर क्रियाशीलता के तहत प्लेटलेट निलंबन के समय के साथ संबधित ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया है। सजातीय निलंबन में प्लेटलेट्स एक एगोनिस्ट के अलावा के बाद प्रकाश के पारित होने की सीमा है, प्लेटलेट आकार परिवर्तन आयुध डिपो में एक छोटे से अस्थायी वृद्धि का उत्पादन होता है। इस प्रारंभिक सक्रियण कदम के बाद, प्लेटलेट थक्के धीरे-धीरे फार्म, एक रेस के रूप में निलंबन के माध्यम से प्रकाश के पारित होने के लिए अनुमति देता हैकी ULT आयुध डिपो की कमी हुई। एकत्रीकरण प्रक्रिया अंततः प्लेटलेट गरीब प्लाज्मा या बफर के आयुध डिपो की तुलना में, एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त की है। कठोर अंशांकन इस प्रकार प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत में आवश्यक है। एक सामान्य नियम के रूप में: अंशांकन के लिए 0% एक गैर प्रेरित प्लेटलेट निलंबन के आयुध डिपो को मापने जबकि निलंबन कोई प्लेटलेट्स युक्त माध्यम के आयुध डिपो को मापने के लिए 100% की एक मूल्य का प्रतिनिधित्व करता द्वारा निर्धारित है। प्लेटलेट एकत्रीकरण आम तौर पर एक वास्तविक समय एकत्रीकरण वक्र के रूप में कल्पना की है। Turbidimetry प्लेटलेट समारोह की जांच के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रयोगशाला तकनीकों में से एक है और ऐतिहासिक सोने के मानक के रूप में माना जाता है और नई दवा प्लेटलेट एकत्रीकरण बाधा के उद्देश्य से एजेंटों के विकास के लिए प्रयोग किया जाता है। यहाँ, हम 1 के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन) मानव की तैयारी प्लेटलेट्स धोया और 2) मानव के कोलेजन प्रेरित एकत्रीकरण के turbidimetric विश्लेषण प्लेटलेट्स भोजन डाई खूब ब्लू FCF कि हाल ही में IDEN था के साथ pretreated धोयाPannexin1 (Panx1) चैनल के एक अवरोध करनेवाला के रूप में tified।
Introduction
प्लेटलेट्स रक्त और जमावट के साथ उनका मुख्य कार्य-साथ के महत्वपूर्ण घटक हैं रक्त वाहिका की चोट के बाद रक्तस्राव को रोकने के कारकों है। प्लेटलेट्स छोटे (2-3 सुक्ष्ममापी) anuclear अस्थि मज्जा 1 की megakaryocytes से ली गई टुकड़े कर रहे हैं। प्लेटलेट्स गैर सक्रिय राज्य में प्रसारित, जिसके दौरान वे लेंस के आकार का संरचनाओं के रूप में दिखाई देते हैं। अन्तःचूचुक में रुकावट होने पर, प्लेटलेट्स छेद, एक प्रक्रिया प्राथमिक hemostasis बुलाया प्लग करने के लिए रक्त वाहिका चोट की साइट के लिए इकट्ठा होते हैं। प्रारंभ में, प्लेटलेट्स ऐसे कोलेजन और वॉन Willebrand कारक के रूप में उप endothelial अणु,, चोट-आसंजन चरण 2 के परिणामस्वरूप संपर्क में हैं कि करने के लिए देते हैं। फिर, वे आकार में परिवर्तन और रासायनिक संदेशवाहकों सक्रियण कदम स्राव करते हैं। अंत में, वे रिसेप्टर्स-एकत्रीकरण कदम को पूरा करने से एक दूसरे से कनेक्ट। प्राथमिक hemostasis एक माध्यमिक फाइब्रिन बयान के साथ जमावट झरना की सक्रियता से जुड़े प्रक्रिया है, जो स्थिर द्वारा पीछा किया जाताप्रारंभिक thrombus 2 है।
ऐसे रोधगलन 3 के रूप में तीव्र इस्कीमिक घटनाओं अक्सर थ्रोम्बी कि एक atherosclerotic पट्टिका की शारीरिक व्यवधान (टूटना) की वजह से फार्म से परिणाम। वर्तमान विरोधी प्लेटलेट दवाओं इस व्यापक बीमारी के इलाज की आधारशिला रहे हैं लेकिन उनके चिकित्सीय लाभ खून बह रहा है के लिए एक बढ़ा जोखिम द्वारा सीमित है। हृदय रोगियों, एस्पिरिन और विरोधी P2Y12 यौगिकों में सबसे निर्धारित दवाओं, थ्राम्बाक्सेन A2 और ADP रास्ते 4, क्रमशः, जो प्रमुख प्लेटलेट सक्रियण के लिए अग्रणी रास्ते को लक्ष्य बना। हालांकि, नए लक्ष्य है कि बेहतर antithrombotic प्रभाव और haemorragic जोखिम संतुलन होगा की दिशा में अभिनव अनुसंधान अभी भी आवश्यक है।
1960 के दशक के 5 आज तक, turbidimetric aggregometry अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, प्लेटलेट प्रतिक्रियात्मकता और मैं के हमारे ज्ञान को बढ़ानेमानव में विरोधी thrombotic अभिकर्मकों की शक्ति की निगरानी एन। Turbidimetry शुरू में रक्त के नमूनों से निकाले पीआरपी के लिए लागू किया गया था। दरअसल, रक्त संग्रह युक्त साइट्रेट प्लेटलेट अखंडता और समारोह पर कोई असर बिना पीआरपी के तेजी से और बड़े उत्पादन की अनुमति देता है ट्यूबों में प्रदर्शन किया। हालांकि, पीआरपी की अल्पकालिक स्थिरता (लगभग 3 ज) और इस तरह के रूप में थ्रोम्बिन शेष Plasmatic एंजाइमों, और संभावित artefactual एकत्रीकरण प्रोफाइल के साथ जुड़े कम कैल्शियम एकाग्रता पीआरपी के उपयोग के लिए प्रमुख असुविधा के हैं। एक महत्वपूर्ण कदम आगे अतिरिक्त centrifugation और वाशिंग 6 दोहराएं साथ प्लेटलेट अलगाव के लिए एक विधि के विकास किया गया है। संक्षेप में, पीआरपी एसिड साइट्रेट-डेक्सट्रोज (एसीडी) पर एकत्र अपरिवर्तित रक्त से अलग है और प्लेटलेट्स धारावाहिक centrifugation चरणों के बाद अलग हो जाती हैं एक आईएसओ-आसमाटिक फॉस्फेट बफर (Tyrode के बफर) युक्त ग्लूकोज, मानव सीरम albumin और द्विसंयोजक ग में resuspended किए जाने से पहलेations (सीए 2 + और मिलीग्राम 2 +)। प्लेटलेट प्रतिक्रियात्मकता में परिवर्तन से बचने के लिए Tyrode के बफर के पीएच ध्यान से 7.35-7.4 पर रखा जाता है। इसके अलावा, प्लेटलेट्स की अवांछित सक्रियण कुछ centrifugation चरणों से पहले (PGI 2) prostacyclin जोड़कर रोका जाता है। अंत में, apyrase के अलावा एटीपी / ADP की कार्रवाई के खिलाफ प्रतिरोधी बनने से धोये प्लेटलेट्स से बचाता है। जिसके परिणामस्वरूप प्लेटलेट निलंबन स्कंदक कारकों का अभाव है और पीआरपी समाधान की तुलना में प्लेटलेट्स की स्थिरता कम से कम दो गुना की वृद्धि हुई है। इसके अलावा, तथ्य यह है कि प्लेटलेट्स निष्क्रिय लेकिन बरकरार वारंट turbidimetric माप के reproducibility कर रहे हैं और सबसे अनुकूल तरीके से एगोनिस्ट या प्लेटलेट एकत्रीकरण के विरोधियों में से कार्रवाई का अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करता है।
इस विधि का उपयोग करना, हम हाल के एक अध्ययन में पता चला है कि एक आनुवंशिक दृष्टिकोण से Panx1 चैनलों के गठन को रोकते (नॉक-आउट चूहों) या औषधीय द्वारा Panx1 चैनल गतिविधि कम हो रहीकम कोलेजन प्रेरित प्लेटलेट एकत्रीकरण 7 दृष्टिकोण। Panx1 एटीपी रिलीज़ चैनल है, जो सर्वत्र मानव प्लेटलेट्स 7, 8 सहित कई प्रकार की कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे रूपों। वास्तव में, हम turbidimetry द्वारा प्रदर्शन पर मानव धोया प्लेटलेट्स कि अधिक या कम विशिष्ट रासायनिक ब्लॉकर्स (प्रोबेनेसिड, mefloquine और 10 Panx1 पेप्टाइड्स) विभिन्न एगोनिस्ट के अलावा करने से पहले के एक पैनल के साथ एक 7 मिनट preincubation, हिचकते विशेष रूप से कोलेजन प्रेरित प्लेटलेट एकत्रीकरण, जबकि ए.ए. और ADP को प्लेटलेट प्रतिक्रियाओं प्रभावित नहीं हुए थे। हम दिखा दिया कि Panx1 चैनलों के माध्यम से एटीपी रिहाई विशेष रूप से GPVI संकेतन मार्ग कोलेजन प्रेरित एकत्रीकरण के लिए अग्रणी में हस्तक्षेप करता है। दिलचस्प बात यह है अन्य बीमारियों (प्रोबेनेसिड, mefloquine) में आवेदन पत्र के साथ कई FDA- स्वीकृत यौगिकों प्लेटलेट्स में Panx1 चैनलों की गतिविधि प्रभावित करते हैं। एक तरफ, यह चयन करने के लिए नई चिकित्सकीय दृष्टिकोण को खोलता हैively प्लेटलेट प्रतिक्रियात्मकता संशोधित करते हैं। दूसरी ओर, एक इन यौगिकों के संभावित माध्यमिक प्रभाव पर विचार करना चाहिए। इस संदर्भ में, सुरक्षित भोजन डाई खूब ब्लू FCF कई कैंडी और ऊर्जा पेय में प्रयोग किया जाता Panx1 9 के एक चयनात्मक अवरोध करनेवाला के रूप में वर्णित किया गया है। हम यहाँ मानव धोया प्लेटलेट्स और प्लेटलेट एकत्रीकरण की turbidimetric माप के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्लेटलेट एकत्रीकरण के एक विरोधी के रूप में खूब ब्लू FCF डाई के प्रभाव की जांच करने के लिए अनुकूलित का वर्णन।
Protocol
Representative Results
Discussion
वहाँ नए आदेश रक्तस्राव का खतरा बढ़ाने के बिना घनास्त्रता को रोकने के लिए प्लेटलेट समारोह modulating में सक्षम दवाओं की खोज में बहुत रुचि है। इस प्रयोजन के लिए इन विट्रो प्रयोगशाला परीक्षणों जो मज़बूती स?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान (310030_162579 / 1 ब्रेंडा रेनाटा क्वाक के लिए और 320030_144150 पियरे फोंटाना के लिए) के साथ ही द्वारा स्विस हार्ट फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | – |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | – |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | – |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | – |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | – |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | – |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | – |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | – |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | – | – |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | – |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | – |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | – |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | – |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | – | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | – |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | – | – |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | – |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | – |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | – |
Riferimenti
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