WinCF मॉडल - एक बलगम का एक सस्ता और विनयशील मनुष्य का सूक्ष्म दर्शन फेफड़े संक्रमण के सूक्ष्म जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए bronchiole प्लग
Summary
बलगम खामियों को दूर सिस्टिक फाइब्रोसिस के वायुमार्ग (CF) रोगियों माइक्रोबियल रोगज़नक़ों पनपने के लिए एक आदर्श वातावरण है। पांडुलिपि कि नकल करता है, जहां वे रासायनिक परिस्थितियों के रोग और कैसे परिवर्तन का कारण माइक्रोबियल गतिशीलता ड्राइव कर सकते हैं वातावरण में सीएफ फेफड़ों Microbiome के अध्ययन के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन है।
Abstract
कई पुराने एयरवे रोगों वायुमार्ग की बलगम plugging में परिणाम। सिस्टिक फाइब्रोसिस के साथ एक व्यक्ति के फेफड़ों एक अनुकरणीय मामले में जहां उनके बलगम-खामियों को दूर ब्रांकिओल्स माइक्रोबियल उपनिवेशन के लिए एक अनुकूल वास बनाने हैं। विभिन्न रोगजनकों इस माहौल को एक दूसरे के साथ बातचीत और CF रोग के साथ जुड़े लक्षण के कई ड्राइविंग में कामयाब। किसी भी माइक्रोबियल समुदाय की तरह, उनके निवास स्थान की रासायनिक परिस्थितियों समुदाय संरचना और गतिशीलता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। उदाहरण के लिए, विभिन्न सूक्ष्मजीवों ऑक्सीजन या अन्य घुला हुआ पदार्थ सांद्रता के भिन्न स्तरों में कामयाब। यह भी सीएफ फेफड़े, जहां ऑक्सीजन सांद्रता समुदाय शरीर विज्ञान और संरचना ड्राइव करने के लिए माना जाता है में सच है। यहाँ वर्णित तरीकों फेफड़ों पर्यावरण नकल करते हैं और अधिक है कि जहां से वे बीमारी का कारण समान तरीके से रोगजनकों विकसित करने के लिए डिजाइन किए हैं। इन रोगाणुओं का रासायनिक परिवेश में हेरफेर तो अध्ययन करने के लिए कैसे chemi प्रयोग किया जाता हैफेफड़ों के संक्रमण का स्टेरी अपने माइक्रोबियल पारिस्थितिकी को नियंत्रित करता है विधि, जिसे WinCF प्रणाली कहा जाता है, कृत्रिम थूक माध्यम और संकीर्ण केशिका ट्यूबों पर आधारित होती है जिसका मतलब आक्सीजन प्लग प्लग ब्रॉन्किलोल में मौजूद ऑक्सीजन ढाल प्रदान करने के लिए होता है। थूक या एंटीबायोटिक दबाव के मीडिया पीएच जैसे रासायनिक परिस्थितियों में हेर-फेर करना, उन नमूनों में सूक्ष्मजीवविज्ञानी अंतर को देखने के लिए अनुमति देता है जो रंग के संकेतकों का उपयोग करते हैं, गैस या बायोफिल्म उत्पादन के लिए देख रहे हैं, या प्रत्येक नमूने के न्यूक्लिक एसिड सामग्री को निकालने के लिए।
Introduction
विधि इस पांडुलिपि में वर्णित WinCF प्रणाली 1 कहा जाता है। WinCF के समग्र लक्ष्य एक प्रयोगात्मक सेटअप एक बलगम से भरे फेफड़ों bronchiole का वातावरण अनुकरण करने में सक्षम प्रदान करना है। यह एक विनयशील प्रणाली सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF), क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी), अस्थमा और अन्य सहित एक बलगम hypersecretion phenotype के साथ फेफड़ों के रोगों की माइक्रोबियल रोगज़नक़ों का अध्ययन करने के लिए अनुमति देगा। प्रक्रिया सीएफ के अध्ययन है, जो उत्परिवर्तन का कारण फेफड़ों के स्राव मोटी और हार्ड स्पष्ट करने के लिए बनने के लिए, अंत में बलगम 2 के साथ ब्रांकिओल्स और अन्य छोटे गलियारों भरने की विशेषता है के लिए विशेष रूप से डिजाइन किया गया था। फेफड़ों में इस तरह की रुकावटों गैस विनिमय रोकना क्योंकि साँस हवा नहीं रह गया है कई एल्वियोली तक पहुँचने और भी बैक्टीरियल उपनिवेशवाद 3, 4 के लिए एक निवास स्थान प्रदान करने में सक्षम है। असमर्थता में माइक्रोबियल विकास को रोकने के लिएअत्यधिक फेफड़ों बलगम अंततः airway के जटिल दीर्घकालिक संक्रमण के विकास के लिए होता है। ये समुदाय, वायरस, कवक, और Pseudomonas aeruginosa की तरह बैक्टीरिया सहित जीवों की एक किस्म के होते हैं सब एक दूसरे के 5, 6, 7, 8 के साथ बातचीत। सीएफ फेफड़ों Microbiome की गतिविधि लक्षण फेफड़े तीव्रता 1, 9, 10, 11 कहा जाता है की फ्लेयर्स में शामिल होना माना जाता है। WinCF इन तीव्रता के आसपास माइक्रोबियल समुदाय व्यवहार के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है और अब फेफड़ों माइक्रोबियल पारिस्थितिकी अध्ययन करने के लिए एक आधार के प्रायोगिक प्रणाली के रूप में कार्य करने के लिए विस्तारित किया जा रहा है। परंपरागत रूप से, तीव्रता फेफड़ों से लिए गए नमूनों की प्रत्यक्ष विश्लेषण के माध्यम से अध्ययन किया गया है। कई कारकों माइक्रोबियल ख के प्रत्यक्ष विश्लेषण करनाWinCF प्रणाली के साथ चुनौती देने वाले फेफड़ों के व्यवहार में, इन कारकों में से कई को हटा दिया जाता है और फेफड़े की सूक्ष्मजीवों के व्यवहार को अधिक सीधे अध्ययन किया जा सकता है, जिससे बलगम-प्लग किए गए ब्रॉन्कियोले में बैक्टीरिया गतिविधि के बेहतर विश्लेषण की अनुमति मिलती है।
WinCF प्रणाली बैक्टीरिया को बढ़ने और विश्लेषण करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है जिससे कि फेफड़े के वातावरण को प्रभावी ढंग से मिमिक्स किया जाता है। बढ़ते फेफड़ों के जीवाणुओं के लिए पारंपरिक तरीके अक्सर पारंपरिक अगर प्लेटों पर संवर्धन नमूनों को शामिल करते थे। इन विधियों ने नमूनों को वायुमंडलीय ऑक्सीजन के लिए खुला छोड़ दिया, फेफड़ों के ब्रोंकोइल में पाए गए हाइपोक्सिक और अक्सर अनॉक्सिक स्थितियों के लिए खासतौर पर बलगम 12 , एरोबिक स्थितियों के तहत अगर पर संगृहीत सीफ फेफड़े के वातावरण की तरह कुछ नहीं है और वे चिकित्सकों और शोधकर्ताओं को उन रोगजनकों के व्यवहार से गुमराह कर सकते हैं जो वे इलाज करने की कोशिश कर रहे हैं। इसके अतिरिक्त, अगर प्लेटों पर बैक्टीरिया के लिए उपलब्ध पोषक तत्ववास्तविक थूक में उपलब्ध उन लोगों के लिए असमान हैं, जो कृत्रिम थूक मीडिया (एएसएम) का उपयोग करके WinCF में शामिल है। जैसा कि श्रीरामू एट अल में स्यूडोमोनस संस्कृतियों द्वारा दिखाया गया है 14 , एएसएम में ऐसे घटकों का एक विशिष्ट समूह शामिल है जो थकावट के रोगियों के लिए उपलब्ध संसाधनों की नकल करते हैं और स्टेमम की शारीरिक स्थिरता का भी प्रतिकृति करते हैं। क्योंकि एक रोगग्रस्त फेफड़े की एक विशिष्ट सूक्ष्मजीव होती है, ऐसे सूक्ष्मजीवों का अध्ययन आदर्श रूप से फेफड़ों की विशिष्ट स्थितियों में भी होना चाहिए।
WinCF प्रणाली तेजी से विश्लेषण और प्रयोगात्मक शर्तों का आसान हेरफेर करने के लिए माइक्रोबियल परिवर्तनों का पालन करने के लिए सक्षम बनाता है जैसा कि वे एक वास्तविक फेफड़ों की ब्रोन्कोइल में होते हैं। इस तकनीक में थूक, लार, अन्य शरीर स्राव और शुद्ध या मिश्रित बैक्टीरिया संस्कृतियों सहित संबंधित नमूना प्रकारों के असंख्य के टीका के लिए अनुमति मिलती है। प्रयोगात्मक सेटअप की प्रकृति के तत्काल दृश्य व्याख्या के लिए अनुमति देता हैमाइक्रोबियल सामुदायिक व्यवहार और सूक्ष्मजीवविज्ञानी और ओमिक्स प्रक्रियाओं की एक भीड़ के आसान डाउनस्ट्रीम आवेदन को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। ऐसे अध्ययन महत्वपूर्ण हैं क्योंकि बैक्टीरिया समुदाय संरचना उनके पर्यावरण के भौतिक-संबंधी स्थितियों के आधार पर बदलती है। WinCF के साथ बैक्टीरिया गतिविधि पर प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए मीडिया के रासायनिक परिस्थितियों में हेरफेर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक नमूने के साथ टीका लगाने से पहले मीडिया की अम्लता को बदला जा सकता है। ऊष्मायन के बाद, इन स्थितियों में से प्रत्येक में बैक्टीरिया गतिविधि सीधे तुलना की जा सकती है, और निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि उन थूक नमूने में बैक्टीरिया कैसे भिन्न पीएच के जवाब में व्यवहार करते हैं। यहां, हम WinCF प्रणाली को लागू करने की प्रक्रियाओं को रेखांकित करते हैं और फेफड़े के माइक्रोबायम पर प्रभावों का अध्ययन करने के लिए मीडिया रसायन विज्ञान का उदाहरण कैसे दिखा सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीएफ के साथ एक फेफड़ों के सूक्ष्मजीवविज्ञानी मेकअप जीवों की एक महान विविधता शामिल है, लेकिन फेफड़ों के भीतर की स्थिति की संभावना एक महत्वपूर्ण प्रभाव क्या पर रोगाणुओं के प्रकार के जीवित रहने और <sup class="xre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को अनुदान 1 U01 AI124316-01 के वित्तपोषण के लिए आर क्विन और एनआईएआईडी / एनआईएआईडी के वित्त पोषण के लिए वेर्टेक्स फार्मास्यूटिकल्स और सिस्टिक फाइब्रोसिस रिसर्च इनोवेशन अवॉर्ड को स्वीकार करना चाहते हैं, जो बहु-औषध प्रतिरोधी रोगजनकों के उपचार के लिए सिस्टम जीवविज्ञान दृष्टिकोण हैं। हम इस काम के इंजीनियरिंग पहलुओं के साथ सहयोग की सुविधा के लिए यूसीएसडी के अंडरग्रेजुएट मैकेनिकल इंजीनियरिंग वरिष्ठ डिजाइन पाठ्यक्रम में मैकेनिकल और एयरोस्पेस इंजीनियरिंग विभाग का भी शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
Riferimenti
- Quinn, R. A., et al. A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation. ISME J . 9, 1024-1038 (2015).
- Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
- Harrison, F. Microbial ecology of the cystic fibrosis lung. Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).
- Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection. Pediatr pulmonol. 50, S31-S38 (2015).
- Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis. Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).
- Willner, D., et al. Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung. ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).
- Delhaes, L., et al. The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community–implications for therapeutic management. PloS one. 7 (4), e36313 (2012).
- Rogers, G. B., et al. D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling. J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).
- Stenbit, A. E., Flume, P. A. Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).
- Twomey, K. B., et al. Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation. PloS one. 8 (12), e82432 (2013).
- Carmody, L. A., et al. Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation. Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).
- Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation. mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).
- Sriramulu, D. D., Lünsdorf, H., Lam, J. S., Römling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).
- Quinn, R. A., et al. Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung. mBio. 5 (2), (2014).
