Методы индуцируют и Quantify Cellular Старение

Summary

Клеточное старение, необратимое состояние остановки клеточного цикла, может быть вызвано различными клеточными напряжениями. Здесь мы описываем протоколы для индукции клеточного старения и методов оценки маркеров старения.

Abstract

В ответ на клеточный стресс или повреждения, пролиферирующие клетки могут вызвать определенную программу, которая инициирует состояние долгосрочной остановки клеточного цикла, называемую клеточным старение. Накопление стареющих клеток происходит с организменном старения и за счет непрерывного культивирования в пробирке. Стареющие клетки влияют на многие биологические процессы, в том числе эмбрионального развития, ремонта и регенерации тканей, подавление опухоли, и старение. Клейма стареющие клетки включают в себя, но не ограничиваются ими, увеличилась Старение-ассоциированные β-галактозидазы (SA-бета-гал); р16 ^Ink4a, p53, p21 и уровней; более высокие уровни повреждений ДНК, в том числе гамма-H2AX; формирование Старение-ассоциированного гетерохроматина очагах (SAHF); и приобретение старении-ассоциированной секреторного фенотипа (SASP), явление, характеризующееся секреции ряда провоспалительных цитокинов и сигнальных молекул. Здесь мы описываем протоколы для обоих репликативной иПовреждения ДНК-индуцированное старение в культивируемых клетках. Кроме того, мы выделим методу для мониторинга стареющего фенотипа с использованием несколько старения-ассоциированными маркеров, включая SA-бету-гала, гамма-H2AX и SAHF окрашивание и количественную оценку уровней белка и мРНК регуляторов клеточного цикла и SASP факторов. Эти методы могут быть применены к оценке старения в различных моделях и тканях.

Introduction

Более полувека назад, Хейфлик и его коллеги описали , как нетрансформированный клетки пролиферируют в культуре, но только в течение ограниченного периода времени ^1. Долгосрочное культивирование человеческих фибробластов вызвало клетку, чтобы остановить пролиферирующие; однако, они были метаболически активными, и это называлось клеточное старение. Старение может быть полезным для ингибирования онкогенеза, но она также может быть вредно, так как это , как полагают, способствуют потере регенерационной способности , что происходит со старением ^{2, 3.} Стареющие клетки , как были показаны, накапливается в тканях , как люди возраст ⁴ и участвуют в ряде биологических процессов, в том числе эмбрионального развития, заживления ран, восстановления тканей, а также связанные с возрастом воспаления ^2.

Постоянные пассажи клеток в культуре индуцирует репликативное старение, который был связанна теломер истощение и нестабильность генома. Различные напряжения клеток, в том числе повреждения ДНК и онкогенов, могут также вызвать старение ^3. Старение вызвано другими , чем теломер истощение факторов часто называют стрессом-индуцированным или преждевременным старением и , как правило , зависит от р16 ^Ink4a / Rb пути ^5. Несмотря на то, пролиферирующих, нетрансформированные клетки обычно появляются шпиндель в форме, стареющие клетки могут быть идентифицированы как имеющие определенные характеристики, в том числе плоскую, большую морфологию и повышенную старении-ассоциированной β-галактозидазы (SA-β-гал) (фиг.1 и 2). Стареющие клетки также накапливаются маркеры повреждения ДНК, в том числе гамма-H2AX (рисунок 3) ^6, и, потенциально, Старение-ассоциированные гетерохроматина очаги (SAHF) (Рисунок 4) ^7. Стареющие клетки имеют более высокие уровни регуляторов клеточного цикла, в том числе р 16 (р16 ^INK4A) и / или р21 и р53 (рисунок 5) ^{8, 9.} Кроме того, недавние данные показали , что стареющие клетки могут иметь неавтономных эффекты, секретирующие ряд про-воспалительных цитокинов и хемокинов называется Старение-ассоциированный секреторной фенотип (SASP) ^10. Хотя это явление SASP может варьироваться в зависимости от типа клеток типа клеток, в общем, это свидетельствует увеличение интерлейкина-6 (ИЛ-6), ИЛ-8, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), growth- регулируемый онкогена α (GRO-α), а также GRO-β, среди других (рисунок 6). Частности , стресс или повреждение , которое вызывает старение может также влиять на секреторную фенотип ^{11, 12, 13.} SASP может быть обнаружен путем измерения уровней секретируемых белков с помощью ELISA, или цитокина / белковых массивовs = "Xref"> ^{10, 14.} Хотя пост-транскрипционные механизмы могут регулировать уровни белка SASP ^{11, 15, 16, 17,} изменения в уровне мРНК также могут быть обнаружены во многих случаях. Эти изменения, как правило, более чувствительны и проще, чем для количественного измерения уровня белка. Другие стареющие маркеры также могут быть оценены, включая стойкие повреждения ДНК ядерных очаги, называемые сегменты ДНК с хроматином изменениями армирующих старения (ДНК-Рубцы) ^18, а также различных другими маркерами ^{3, 19, 20.}

Здесь мы опишем общие методы для индукции старении в клетках в культуре, а также для измерения нескольких маркеров старения, включая SA-бета-Gal, гамма-H2AX, SAHF, и белок и мРНК стареютсть-ассоциированных молекул.

Protocol

1. побуждающих Репликативного Старение Оттаивания низкого прохода фибробласты диплоидного человека (например, WI-38 и IMR-90) или другие клеточные линии. Примечание: В данном случае были использованы диплоидные фибробласты человека, но эти протоколы могут быть использованы д…

Representative Results

На рисунках 2 – 6 показывают репрезентативные результаты от SA-β-гал окрашивания; окрашивания для гамма-H2AX и SAHF; оценка уровней белка р16, р21 Ink4a и р53; и мРНК и уровни белка стареющих-ассоциированных молекул. Увеличение SA-β-гал окрашивание происходит с реплик?…

Discussion

Здесь мы описали способы репликативной и ДНК-повреждений, вызванных старением с использованием диплоидных фибробластов человека. Кроме того, методы для количественного определения белка и уровни мРНК различных стареющих-ассоциированных белков включены, а также для окрашивания SA-бет…

Materials

16% Tris-glycine gels	Invitrogen	XP00160BOX
Acid-Phenol ChCl3	Ambion	AM9720
Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody	Invitrogen	A11031	1:300 dilution
Cell lifters	Corning Inc.	3008	Cell scraper
ECL anti-mouse HRP linked antibody	Amersham	NA931V
ECL Plus Western Blotting Substrate	Pierce	32132	ECL
DAPI	Molecular Probes	MP01306	stock 5 mg/ml in dH2O
GAPDH antibody	Santa Cruz	sc-32233	1:1,000-5,000 dilution
GlycoBlue	Ambion	AM9515
Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody	Abcam	1220	1:500 dilution
Human IL-6 Quantikine ELISA assay	R&D systems	D6050
Human IL-8 Quantikine ELISA assay	R&D systems	D8000C
Human GROa Quantikine ELISA assay	R&D systems	DRG00
N-N-dimethylformamide	Sigma	D4551	DMF
p16 monoclonal antibody	BD Biosciences	51-1325gr	1:500 dilution
p21 monoclonal antibody	Millipore	05-345	1:750 dilution
p53 monoclonal antibody	Santa Cruz	sc-126	1:500 dilution clone DO-1
phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody	Cell Signaling	9719	1:2000 dilution
POWER SYBR-green PCR master mix	Applied Biosystems	4367659
Pre-stained molecular weight markers	Biorad	161-0374
ProLong Gold Antifade	Invitrogen	P36930
PVDF membrane	Thermo Scientific	88518
Senescence b-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling	9860
TRIzol	Ambion/Life Tech	10296028