Racine Dorsale Ganglion Injection et Racine Dorsale Crush blessures comme modèle pour la régénération sensorielle Axon
Summary
This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.
Abstract
Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.
Introduction
La réalisation de la régénération axonale après une lésion du système nerveux est une tâche difficile 1. Pour étudier l'échec de la régénération axonale dans le système nerveux central (SNC), les chercheurs ont utilisé une pléthore de modèles de lésions nerveuses. Comme les régions du système nerveux central diffèrent, il est important d'utiliser un modèle anatomique approprié pour étudier la régénération des axones. En utilisant le modèle approprié, les chercheurs peuvent formuler un traitement spécifique en fonction de la gravité des blessures, le type d'intérêt des cellules neuronales, et les voies de la colonne vertébrale souhaitée pour l'évaluation de la régénération, par opposition à un « un pour tous » stratégie de traitement.
Dans lésion de la moelle épinière, par exemple, les symptômes les plus débilitants proviennent de la perte de la sensation et de la locomotion. La perte de sensation est causée par des dommages aux voies sensorielles ascendant, alors que la perte de locomotion est causée par des dommages aux voies motrices descendantes. En raison des différences cellulaires et anatomiques entre ces two les voies, de nombreuses études de régénération des axones ciblées se concentrent uniquement sur l'un ou l'autre voie, la raison d'être que la reprise réussie des deux serait un avantage énorme pour les patients. Dans cet article, nous présentons un protocole qui utilise une injection ganglions de la racine dorsale directe (DRG) avec un vecteur viral et une lésion par écrasement simultané de la racine dorsale dans la moelle épinière cervicale inférieure d'un rat adulte en tant que modèle pour étudier la régénération des axones sensoriels.
DRG neurones sensoriels sont responsables de la transmission de l'information sensorielle, comme sensation tactile et la douleur, de la périphérie vers le système nerveux central. Les longues projections axonales de neurones sensoriels de la moelle épinière constituent un bon modèle pour étudier la régénération axonale à longue distance. En outre, comme les rongeurs peuvent survivre à une lésion de la voie sensorielle comme une blessure à l'écrasement de la racine dorsale avec des complications de protection minimales, les chercheurs peuvent étudier du système nerveux central la régénération des axones sans la nécessité de lésion complètement la moelle épinière. Un quadruple C5 – C8 (l cervicalEvel 5 – 8) racine lésion par écrasement dorsale a été démontré être un modèle utile pour forepaw déafférentation 2. En outre, une blessure à l'écrasement de la racine dorsale fournit un « plus propre » modèle pour étudier la régénération axonale qu'une lésion de la moelle épinière directe car il est simple par d'autres facteurs tels que la formation de cicatrice gliale.
L'utilisation de la thérapie génique virale neurones dans un reprogrammez état de régénération a été de plus en plus considéré comme une stratégie thérapeutique prometteuse pour de nombreuses affections neurologiques 3. Des études ont montré l'application d'un vecteur portant le transgène d'une protéine favorisant la croissance de virus adéno-associé (AAV) peut réaliser la régénération des axones robuste avec récupération comportementale 4, 5, 6. La pathogénicité apparemment faible de l'AAV pour induire une réponse immunitaire et la capacité de transduire des cellules non en division, telles que les neurones, faitesil le vecteur optimal pour la thérapie génique. De plus, la forme de AAV recombinant est utilisé pour la thérapie. Sous cette forme, il est incapable d'intégrer son génome viral dans le génome hôte 7, ce qui réduit le risque de mutagenèse insertionnelle par rapport à d' autres vecteurs viraux, tels que lentivirus. Cela rend AAV un choix sûr pour les applications de thérapie génique.
En tant que DRG contient les corps cellulaires des neurones sensoriels, il est la cible anatomique la plus appropriée pour l'administration du virus pour la thérapie génique pour étudier et / ou favoriser la régénération axonale sensorielle. Dans une étude comparant différents sérotypes d'AAV et des lentivirus, sérotype AAV 5 (AAV5) a été représenté pour être le plus efficace dans la transduction neurones DRG sur un parcours de temps d'au moins 12 semaines lorsqu'il est injecté directement dans le DRG 8. De plus, l'AAV peut atteindre plus de 40% l'efficacité de transduction, tous les sous-types de neurones transduction DRG, tels que le grand diamètre neurofilament 200 kDa(NF200) -positif neurones et le petit diamètre de la calcitonine gene-related peptide (CGRP) – ou isolectine B4 (IB4) -positif neurones 4, 8.
Comme la procédure chirurgicale d'injection DRG et la racine lésion par écrasement dorsale est extrêmement envahissante et délicate, nous pensons que cet article vous aidera les nouveaux utilisateurs à apprendre la procédure d'une manière très efficace. Dans cet article, nous montrons des résultats représentatifs de rats adultes quatre semaines après l'injection d'un virus de contrôle AAV5-GFP (protéine fluorescente verte) en C6 – C7 DRG avec une C5 concurrente – C8 racine lésion par écrasement dorsale. Ce modèle est particulièrement adapté pour les chercheurs qui enquêtent sur l'utilisation de la thérapie génique virale pour favoriser la régénération axonale sensorielle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous présentons un guide étape par étape pour effectuer une injection de DRG et la racine lésion par écrasement dorsale de la moelle épinière cervicale inférieure d'un rat adulte. Comme il est une chirurgie très invasive et délicate, nous recommandons vivement que tous les utilisateurs potentiels obtiennent une formation suffisante et pratique avant de passer à vivre la chirurgie animale. Les utilisateurs doivent se familiariser non seulement avec l'anatomie de la moelle épinière, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Christopher et Dana Reeve Foundation, le Conseil de recherches médicales, le Conseil européen de la recherche ECMneuro et le Centre de recherche biomédicale Cambridge NHMRC. Nous tenons à exprimer notre profonde gratitude à Heleen Merel van « t Spijker et Justyna Barratt pour leur assistance technique pendant le tournage. Nous tenons à remercier le Dr Elizabeth Moloney et le professeur Joost Verhaagen (Institut néerlandais des neurosciences) pour aider à la production d'AAV.
Materials
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
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