I laser sono spesso utilizzati in studi di risposta cellulare al danno del DNA. Tuttavia, essi generano lesioni la cui spaziatura, frequenza, e collisioni con forcine di replicazione sono raramente caratterizzati. Qui, descriviamo un approccio che consente la determinazione di questi parametri con laser localizzato legami crociati interstrand.
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Articolo metodologico
Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti
In questo articolo
Sommario
Abstract
La risposta al danno del DNA (DDR) è stato ampiamente caratterizzato in studi di rotture dei filamenti doppi (DSB) indotta dal laser micro irradiazione con fascio di cellule vive. DDR a Helix distorsione modificazioni covalenti DNA, tra interstrand legami crociati DNA (ICL), non è così ben definita. Abbiamo studiato la DDR stimolato da ICL, localizzato dalla fotoattivazione laser di psoraleni immunotagged, nei nuclei delle cellule vive. Per affrontare domande fondamentali sulla distribuzione addotto e incontri replica forcella, abbiamo combinato localizzazione laser con altre due tecnologie. fibre di DNA sono spesso utilizzati per visualizzare l'avanzamento delle forche di replicazione mediante immunofluorescenza di analoghi nucleosidici, incorporati durante impulsi brevi. puntini Immunoquantum sono stati ampiamente utilizzati per l'imaging singola molecola. Nel nuovo approccio, fibre di DNA da cellule portatrici laser localizzato ICLs sono distribuite su vetrini da microscopio. Le targhette ICL vengono visualizzati con punti immunoquantum e the distanze tra le lesioni determinate. collisioni replica forcella con ICL possono essere visualizzati e diversi modelli incontro identificate e quantificate.
Introduzione
DNA è sotto costante aggressione dagli agenti esogeni come radiazione, luce ultravioletta, tossine ambientali, prodotti di combustione, ecc Inoltre, è attaccato anche da specie radicaliche endogene prodotte dal metabolismo ossidativo. Tutti questi hanno il potenziale di distruggere chimicamente o fisicamente l'integrità del DNA 1. Perturbazioni nel genoma possono attivare la risposta al danno del DNA (DDR), un reclutamento e post traslazionale modifica a cascata con centinaia, se non migliaia, di proteine e microRNA coinvolti nella riparazione della lesione, regolazione del ciclo cellulare, apoptosi, senescenza e vie infiammatorie
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Protocollo
1. Preparazione di Dig-TMP
- Mescolare 50 mg (0,18 mmoli) di 4'-clorometil-4,5' , 8-trimethylpsoralen e 590 mg (2,7 mmoli) di 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-ammina in 25 mL asciutto rotondo pallone -bottom sotto azoto. Aggiungere 10 ml di toluene e riflusso per 12 ore. Rimuovere il solvente in un evaporatore rotante sotto pressione ridotta.
- Purificare il residuo da cromatografia flash su colonna su gel di silice. Eluire la colonna con cloroformio, metanolo, e la soluzione di ammoniaca al 28% (9: 1: 0,5). Evaporare il solvente in un evaporatore rotante sotto pressione ridotta, e recuperare il puro 4 '- [N- (13-ammino-4,7,....
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Risultati
Localizzate Dig-TMP (Figura 1A) ICLs laser possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza contro la Dig-tag collegato al psoraleni. Anche se il laser può essere diretto a colpire in un'area di qualsiasi contorno, le strisce non sono forme "naturali" nelle cellule, e segnali legittimi possono essere facilmente distinguibili da artefatti dovuti al legame non specifico degli anticorpi primari o secondari. Questa funzione è utile quando si utilizzano g.......
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Discussione
La tecnologia di localizzazione laser richiede l'uso di cellule aderenti con nuclei che sono visibili in microscopia in campo chiaro. Abbiamo cercato di attaccare le cellule non aderenti, quali linfociti primari o cellule coltivate debolmente aderenti come AD293, alla superficie di vetro con preparazioni adesive cella come polilisina o collagene, o miscele più complesse. Anche se questi trattamenti possono legarsi alle cellule di superficie, troviamo che essi rimangono generalmente arrotondata che rende molto diffic.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) e il Fondo di ricerca Anemia di Fanconi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Digoxigenina NHS estere | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Cloro-psoralene | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglicole | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiammina |
| Cloroformio | Acros Organics | 423550040 | |
| Metanolo | Fisher Scientific | A4524 | |
| Soluzione di ammonio | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC piastre | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Colonna in vetro Flass 24/40, 100 mL | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Microscopio confocale a disco rotante Nikon T2000_E2, dotato di tavolino automatizzato e camera di controllo ambientale e portapiastra | Perkin Elmer | con software Volocity | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | con un laser pulsato all'azoto | |
| cella di colorante | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 colorante | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| Lastre botomm in vetro da 35 mm 1,5 vetrino, diametro vetro 10 mm, vetrini per | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| New | Comer Supply | Part # 5070 | Nuovi vetrini silani |
| Anticorpo anticorpo BrdU del topo (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 su 40 |
| Anticorpo anti BrdU per ratto (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 su 200& nbsp; |
| Coniglio anti Dig anticorpo | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 su 200 |
| Q-dot 655 capra anti Coniglio IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 su 5.000 |
| AF647- capra anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 su 100 |
| AF488-capra anti topo IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 su 100 |
| Zeiss epifluorescente microscopio A200 | Zeiss | con software Axiovision | |
| Filtro Q-dot 655 | Chroma | 39107 |
Riferimenti
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272(2....
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Ristampe e permessi
