Small RNA Transfección en células primarias Th17 humano por Next Generation electroporación
Summary
Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.
Abstract
CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.
Introduction
Células T CD4 + son orchestrators cruciales de la respuesta inmune adaptativa. Células T CD4 + vírgenes son capaces de desarrollar en varias células T efectoras diferentes (por ejemplo, Th1, Th2, Th17, etc.), cada uno con su propio conjunto de citocinas características y factores de transcripción, dependiendo de la microentorno local 1. Las decisiones del linaje que las células T hacen son críticos tanto para la inmunidad protectora y la tolerancia a la libre. Células Th17 son un subconjunto de células T conocidos para combatir bacterias y hongos extracelulares, pero sus respuestas incorrectas también están implicados en la patogénesis de múltiples enfermedades autoinmunes e inflamatorias tales como esclerosis múltiple y psoriasis 2, 3. Células Th17 humanos pueden ser generados a partir de células T CD4 + vírgenes in vitro, proporcionándoles un ambiente de polarización apropiado 4. Vario nos combinaciones de las citoquinas IL-1β, IL-23, TGF, y IL-6 se han utilizado para el desarrollo de las células Th17 humanos. Células Th17 humanos expresan CCR6, un receptor de quimioquinas que se utiliza comúnmente para identificar esta población de células y se define por la expresión de su director factor de transcripción, RORγt (codificada por RORC) 5, 6. células Th17 tienen la capacidad de expresar múltiples citocinas, pero IL-17A es la citoquina efectora linaje-definir producido por estas células. Se examinó la expresión de los tres marcadores Th17-asociado (CCR6, RORγt, IL-17A) para evaluar la solidez de nuestro ensayo de diferenciación humana Th17 in vitro. Además, se cultivaron células T CD4 + humanas en condiciones no polarización, donde no se añadieron citoquinas o anticuerpos de bloqueo a los medios de cultivo para su uso como un control negativo ya que la expresión de estos marcadores Th17 debe ser muy baja o ausente.
ve_content "> Una manera de estudiar el desarrollo humano normal T biología celular y es manipular la expresión génica durante su desarrollo.-ARN corto de interferencia (ARNsi) son pequeñas moléculas de ARN sintéticos que se dirigen a ARNm codificantes de proteínas y pueden ser utilizados para reducir la expresión de genes específicos . microARNs (miARN) son endógenos no codificantes ARN pequeños conocidos para modular la expresión del gen post-transcripcionalmente. miRNAs han sido demostrado que desempeñan un papel importante tanto en murino y la biología de células T humanas, incluso en las células Th17 7, 8, 9. se es crucial tener métodos fiables de manipulación de la actividad de ARN pequeño en las células T humanas para estudiar sus efectos sobre la expresión de genes y en última instancia, sobre la biología de células T humanas. a continuación, describimos un protocolo fácil de uso, consistente y fiable que hemos desarrollado para introducir pequeños RNAs sintéticos y ácidos nucleicos bloqueados (LNA, modificar químicamente los ácidos nucleicos con una mayor estabilidad)en células inmunes, y específicamente en células Th17 humanos.Hay varios métodos alternativos de introducción de pequeños ARN en células de mamífero, que generalmente se dividen en categorías químicas, biológicas o físicas 10. métodos químicos normalmente usados, incluyendo transfecciones basadas en lípidos y transfecciones de calcio-fosfato, se basan en la creación de complejos de ADN-químico que se toman más eficientemente por las células. En general, los métodos químicos no son tan eficientes para la transfección de células T primarias. El método biológico más común es usar un vector viral (por ejemplo, retrovirus o lentivirus), que inserta directamente ARN extraño en un huésped como parte de su ciclo de replicación natural. transducción viral típicamente tarda más tiempo en completar, especialmente cuando se toma en cuenta el tiempo para la clonación molecular de los plásmidos proviral. Además, los vectores virales de transducción pueden ser potencialmente dañinos para los investigadores humanos. La electroporación es un m físicaétodo de inducir permeabilización de la membrana sometiendo las células a pulsos de alto voltaje, permitiendo que los ácidos nucleicos para introducir transitoriamente en la célula donde pueden actuar en su objetivo. instrumentos de electroporación tradicionales no eran eficaces para transfectar linfocitos primarios. Sin embargo, optimizado siguiente electroporación generación ha demostrado ser capaz de transfectar las células T a muy alta eficiencia, especialmente cuando el material a transfectar es pequeño ARN. El término próxima generación se utiliza libremente para diferenciar las dos plataformas más recientes (por ejemplo, neón, Amaxa) de máquinas de electroporación tradicionales. Además, este método es fácilmente escalable para pantallas de rendimiento moderados con hasta aproximadamente 120 pequeños RNAs en un solo experimento, a menudo utilizando reactivos sintéticos validados. Es importante destacar que las transfecciones con éxito se puede lograr en tan poco como 16 h después de la activación de células T. La desventaja de este método, sin embargo, es que no da como resultado de plástic genómico establesucesivamente, y es por lo tanto transitoria. Por lo tanto, vale la pena el esfuerzo extra para crear una construcción de expresión estable que puede ser empaquetado en un vector viral y se expresó con éxito en las células T en los casos en que se requiere la expresión a largo plazo de un pequeño ARN.
Hemos utilizado una próxima generación de transfección (por ejemplo, neón) para ofrecer diversas herramientas sintéticos individuales o de doble hebra de ARN o de oligonucleótidos LNA para diferentes propósitos 11, 12, 13. la interferencia de ARN eficiente puede ser inducida en el ratón primario y las células T humanas utilizando ARN-interferencia corto de doble hebra (siRNA). Este protocolo describe condiciones optimizadas para el uso de esta técnica en las células Th17 humanos. Además de siRNAs, disponibles comercialmente imita e inhibidores de miARN sintéticos pueden ser utilizados para estudiar el aumento de miARN y pérdida de función. imita miARN son moléculas de ARN de doble cadena muy similares a siRNAs, pero designed con la secuencia de miRNAs maduros endógenos. inhibidores de miARN están químicamente modificados de ARN y / o LNA basado oligonucleótidos monocatenarios que se unen a miRNAs nativas y antagonizan su función. Hemos encontrado que todas estas herramientas se pueden utilizar de manera efectiva en los linfocitos T primarias cultivadas, incluyendo pero no limitado a las células Th17 humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo proporciona un método mejorado para el suministro de pequeños ARN en células Th17 humanos. Aunque se utilizaron células Th17 humanos aquí, este método de electroporación con pequeños ARN se puede utilizar con otros subconjuntos helper humano primario T, tales como Th1, Th2, y Tregs. No ha funcionado bien para las células T CD4 + vírgenes por lo que las células deben ser activadas en cultivo antes de la transfección. Para este protocolo, primero optimizado el sistema de cult…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the US National Institutes of Health grants (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), a Leukemia & Lymphoma Society scholar award (K.M.A.), and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).
Materials
| anti-human IL-17A PE | ebioscience | 12-7179-42 | Clone: eBio64DEC17 |
| anti-human IFNg FITC | ebioscience | 11-7319-82 | Clone: 4S.B3 |
| anti-human CD4 eVolve605 | ebioscience | 83-0047-42 | Clone: SK3 |
| mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 | BD biosciences | 562515 | Clone: 11A9 |
| anti-human RORgt AF647 | BD biosciences | 563620 | Clone: Q21-559 |
| anti-human CD45 eFluor450 | ebioscience | 48-9459-42 | Clone: 2D1 |
| Foxp3/Trascription Factor Staining Buffer Set | ebioscience | 00-5523-00 | For intracellular transcription factor flow cytometry staining |
| Hu FcR Binding Inhibitor Purified | ebioscience | 14-9161-71 | |
| ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium | Stemcell Technologies | 10981 | "Serum-Free Base Media" |
| MACS CD28 pure functional grade, human | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | Clone: 15E8 |
| anti-human CD3 Purified | UCSF monoclonal antibody core | N/A | Clone: OKT-3 |
| LEAF purified anti-human IL-4 | Biolegend | 500815 | Clone: MP4-25D2 |
| anti-human IFNg, functional grade purified | ebioscience | 16-7318-85 | Clone: NIB42 |
| Recombinant human IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| Recombinant human IL-1β | Peprotech | 200-01B | |
| Recombinant human TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool Human RORC | Dharmacon | M-003442-00 | |
| siGENOME SMARTpool Human PTPRC | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | ThermoFisher Scientific | 11346D | Human CD4+ T cell Isolation Kit |
| Neon Tranfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Next generation electroporation instrument |
| Neon Tranfection System 10 μl Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Resuspension Buffer T | ThermoFisher Scientific | Provided in kit (MPK1096) | "Transfection Resuspension Buffer" |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | #07801 | Density Gradient Medium |
| costar 6-well tissue culture treated plates | Corning | 3516 | flat bottom plates |
| costar 48-well tissue culture treated plates | Corning | 3548 | flat bottom plates |
| BD Pharm Lyse lysing buffer, 10 X | BD biosciences | 555899 | Must make 1X solution with distilled water prior to use |
Riferimenti
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