Burada, sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi ile, Staphylococcus aureus ve bunların daha sonraki analiz metabolitlerin ekstraksiyonu için bir protokol açıklar.
bakteriyel patojenler engellemek için bir çaba, ana sıklıkla enfeksiyon yerinde besinlerin kullanılabilirliğini sınırlamaktadır. Bu sınırlama düzenleyici faktörler hücresel metabolizmayı ayarlayarak, cevap hangi anahtar metabolitlerin bolluklarını değiştirebilir. Son yıllarda, proteinler ve RNA bir dizi hastalık oluşturma gen ekspresyonunun önemli regülatörleri olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, Cody proteini dallı zincirli amino asitler ve GTP seviyelerine yanıt ve yaygın olarak düşük G + C Gram-pozitif bakteriler ile muhafaza edilir. Staphylococcus aureus küresel regülatör olarak, Cody virülans ve metabolik genlerin onlarca ifadesini kontrol eder. Biz S. aureus Cody, kısmen, potansiyel konak ortamında karşılaşılan besin sınırlayıcı koşullara uyum sağlama çabası içinde olan metabolik durumunu değiştirmek için kullandığı varsayımında. Bu makale kütle spektrumu ile birleştiğinde sıvı kromatografisi kullanılarak S. aureus metabolitleri çıkarılması ve analiz edilmesi için bir yöntem tarif etmektedirtrometry, bu hipotezi test etmek için geliştirilen bir protokoldür. yöntem ayrıca, sürekli kemostat kültürlerin kullanmadan biyolojik kararlı duruma ve sürekli havalandırma sağlamak gibi titizlik ve tekrarlanabilirlik sağlayacaktır iyi uygulamaları, vurgulamaktadır. USA200 metisiline duyarlı S. aureus Bağıl UAMS-1 ebeveyn soy izole izogenik codY mutantı aspartat (örneğin, treonin ve izolösin) elde edilen amino asit önemli artışlar sergilemiştir ve (bunların ön azalır, örneğin aspartat ve O-asetilhomoserin ). Bu bulgular, bir RNA seq analizi ile elde edilen transkripsiyon veriler ile iyi bir korelasyon: Cody boş mutantta 10- ve 800-kat arasında up-regüle bu yolların genler idi. transcriptome ve metabolom küresel analizlerini Coupling çevresel veya beslenme stresle karşılaştıklarında bakteri phys içine potansiyel kavrayış sağlayan onların metabolizmasını değiştirebilir nasıl ortaya çıkarabilirbesin tüketme ile ilişkili iological değişiklikler enfeksiyon sırasında yaşadı. Bu bulgular, yeni anti-infektifler ve terapötik maddelerin geliştirilmesi için yol açabilecektir.
Bakteriyel patojenler konak ortamında birçok zorluklarla uğraşmak zorundadır. Bağışıklık hücreleri tarafından doğrudan saldırısına ek olarak, ev sahibi de, bakterinin yaşamda kalması ve çoğaltma üreten beslenme bağışıklık 1, 2 temel besin ayrı tutmaktadır. Bu düşmanca ortamlarda hayatta kalmak için, bakteriyel patojenler virülans faktörleri dağıtın. Bu faktörlerin bazıları bakteriler bağışıklık karşılığına izin; diğer faktörler doku türevi bileşenleri 3, 4, 5, tüketerek eksik besin doldurmak için bakteri sağlayabilir, örneğin hiyaluronidaz, thermonuclease ve lipaz gibi sindirim enzimleri, salgılanan içerir. Gerçekten de, bakteriler virülans, 6 faktörleri 7 üretimine hücrenin fizyolojik durumunu bağlayan düzenleyici sistemleri gelişmiştir, <s class = "xref"> 8, 9, 10 kadar.
Artan miktarda kanıt vücut metabolizmasını ve virülans bağlayan kritik bir regülatör olarak Cody işaret ediyor. İlk dipeptit permeaz (DPP) gen 11 bir bastıncısı olarak Bacillus subtilis keşfedilmiştir, ancak Cody hemen hemen tüm düşük G + C Gram-pozitif bakteriler 12, 13 tarafından üretildiği bilinmektedir ve düzenler karbon katılan genlerin onlarca azot metabolizması 14, 15, 16, 17, 18, 19. Patojenik türlerde, Cody, en önemli hastalık oluşturma gen 20, 21 bazı ekspresyonunu kontrol,. ef "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody ligandların iki sınıf ile bir DNA-bağlama proteini olarak aktive edilir: dallı zincirli amino asitler (BCAAs, izolösin, lösin ve valin [ILV]) ve GTP transkripsiyonu bu besinler bol olduğunda., Cody bastırmaktadır (ya da bazı durumlarda, uyarır). bu besin sınırlı hale geldikçe, Cody aktivitesi aşamalı olarak azalır,-yolları yeniden merkezi metabolizmaya bağlı çeşitli metabolik yollar aracılığıyla öncüleri bir kademeli transkripsiyonel yanıt olarak ortaya çıkan 28, 29, 30.
Kütle spektrometrisi (LC-MS) bağlanmış Tandem sıvı kromatografisi doğru küçük moleküllü hücre içi metabolitler 31 tanımlamak ve miktarını güçlü bir tekniktir. transkripsivonel ile eşleştirilmiş zamanriptome analizi (örneğin, RNA-Dizi), bu analitik akışı çevresel veya beslenme stres yanıt olarak oluşan fizyolojik değişiklikler hakkında fikir verebilir. Burada, LC-MS ile Staphylococcus aureus hücreleri ve daha sonra analiz metabolit ekstraksiyonu için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım S. aureus fizyolojisi üzerinde Cody pleiotropik etkilerini göstermek için kullanılmıştır.
Tüm küçük moleküllü metabolitleri merkez metabolik yollardaki ortak kökenli aracılığıyla birbirine bağlanır. üstel büyüme sırasında, bakteriyel hücreler, belirli koşullar altında, fizyolojik durumunun bir görüntü sağlar, biyolojik ve metabolik kararlı halde bulunmaktadır. Cody ilv ve GTP yanıt vererek besin yeterliliğini izler. Ilv ve GTP havuzları damla olarak, Cody aktivitesi büyük olasılıkla artan besin tüketme 30 artan uyum, hedef genlerin ekspresyonunu ayar…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, bir Kurtuluş Ödülü NIH Pathway (GM 099893 hibe) ve fakülte başlangıç fonları SRB yanı sıra bir Araştırma Projesi Grant (GM 042219 hibe) tarafından kısmen finanse edildi. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve yorumlama veya yayın için çalışmalarını göndermek için karar hiçbir rolü olmuştur.
Material/Equipmenta | |||
DeLong Culture Flask (250 ml) | Belco | 2510-00250 | |
Sidearm Flask, 500 ml | Pyrex | 5340 | |
3-hole Rubber Stopper, #7 | Fisher | 14-131E | |
Stainless Steel Filter holder/frit | VWR | 89428-936 | |
Petri Dish, 35 mm | Corning | 430588 | Not tissue culture treated |
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size | Millipore | GSWP02500 | |
Impact-resistant tubes, 2 ml | USA Scientific | 1420-9600 | |
Silica Beads, 0.1 mm | Biospec Products Inc | 11079101Z | |
Precellys 24 homogenizer | Bertin Instruments | EQ03119-200-RD000.0 | |
Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce (Thermo Scientific) | 23235 | |
Cogent Diamond hydride type C column | Agilent | 70000-15P-2 | |
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series | Agilent | G6230B | |
Quat Pump, 1290 Series | Agilent | G4204A | |
Bin Pump, 1290 Series | Agilent | G4220A | |
Valve Drive, 1290 Series | Agilent | G1107A | |
Isocratic Pump, 1290 Series | Agilent | G1310B | |
TCC, 1290 Series | Agilent | G1316C | |
Sampler, 1290 Series | Agilent | G4226A | |
Thermostat, 1290 Series | Agilent | G1330B | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemical | |||
Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211825 | |
Difco Agar, Granulated | Becton Dickinson | 214530 | Solid media contains 1.5% [w/v] agar |
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X | Ambion | AM9624 | Dilute fresh to 1X with ultra-pure water |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-500 | Optima LC-MS |
Methanol | Fisher Scientific | A456-500 | Optima LC-MS; toxic |
Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318 | For mass spectrometry, 98% |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
MassHunter | Agilent | G3337AA | |
Bacterial Strain | Species | Strain | Genotype |
SRB 337 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | wild type |
SRB 372 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | ΔcodY::erm |
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies. |