Summary

Un<em> In Vitro</em> Ensemble de liaison de caséine qui prédit la pénétration des drogues dans les lésions tuberculeuses

Published: May 08, 2017
doi:

Summary

Nous décrivons ici une méthode de dialyse à l'équilibre rapide (RED) pour mesurer la liaison du médicament à la caséine à partir de lésions et cavités de la tuberculose pulmonaire. Le protocole est également utilisé avec une matrice dérivée de macrophages en mousse qui est un substitut efficace à la casée.

Abstract

L'éradication de la maladie de la tuberculose nécessite des schémas thérapeutiques qui peuvent pénétrer dans les couches multiples de lésions pulmonaires complexes. La distribution des médicaments dans les noyaux caséeuses des cavités et des lésions est particulièrement crucial car ils abritent des bactéries sous-populations tolérantes médicaments communément appelés persisters. Les procédés existants pour la mesure de la pénétration du médicament dans les lésions de la tuberculose comportent in vivo coûteuses et longues études pharmacocinétiques couplés à des techniques de bioanalyse ou d' imagerie. A été proposé La mesure in vitro du médicament se liant à des macromolécules caseum comme une alternative à ces techniques étant donné que cette liaison entrave la diffusion passive de molécules de médicament à travers caseum. dialyse d'équilibre rapide est un système rapide et fiable pour effectuer des protéines plasmatiques et des études de liaison de tissus. Dans ce protocole, nous avons utilisé un dispositif de dialyse d'équilibre rapide (RED) pour mesurer la liaison à la drogue broyats de caseum qui est EXCISDes lésions et des caries des lapins infectés par la tuberculose. Le protocole décrit également comment générer une matrice de substitution à partir de macrophages THP-1 chargés de lipides à utiliser à la place du caséum. Cet essai de liaison caseum / substitution est un outil important dans la découverte de médicaments contre la tuberculose et peut être adapté pour aider à étudier la distribution de médicaments dans des lésions ou des abcès causés par d'autres maladies.

Introduction

Le traitement de la maladie de la tuberculose pulmonaire exige une distribution efficace des médicaments dans différents types de lésions. des lésions nécrotiques et les cavités contiennent des centres caséeux qui abritent des sous-populations de bactéries tolérantes à la drogue ou « persistant ». 1, 2 La maladie cavitaire est associée à des taux de guérison inférieurs et un mauvais pronostic. 3, 4 études antérieures ont montré, en utilisant des techniques quantitatives et d' imagerie, que la capacité de pénétrer caseum varie considérablement d'une classe de médicaments à l' autre. 5, 6 Ces méthodes nécessitent cependant l'utilisation de modèles d'infection des animaux qui sont lents et fastidieux. Un dosage in vitro qui mesure la liaison au médicament ex vivo caseum a été conçu. Cette liaison a été trouvé en corrélation inverse avec la pénétration des médicaments dans les granulomes caséeux et, par conséquent, estutilisé comme un outil de prédiction. 7

dialyse d'équilibre est considéré comme l'approche standard de l'or à des études de liaison aux protéines plasmatiques. Le dispositif de dialyse d'équilibre rapide (RED) offre un moyen rapide, facile à utiliser et système fiable pour effectuer ces tests. 8 Le dispositif est constitué de deux composants: à usage unique, jetable , comprenant des inserts 2 chambres séparées par un cylindre vertical de la membrane semi-perméable; et les plaques de base réutilisable qui peut contenir jusqu'à 48 inserts à la fois. La membrane de dialyse a un qui est idéal pour des études de liaison à la drogue macromolécule de coupure 8 kDa de poids moléculaire (MWCO). Le rapport des volumes zone superficielle élevée du compartiment de membrane permet une dialyse rapide et équilibration. Les deux inserts et la plaque de base ont été validés pour une liaison non spécifique minimale. La combinaison du dispositif RED avec des techniques bioanalytiques fournit des estimations précises des fractions non liées de médicaments en pLasma. 8, 9

Bien que conçu à l'origine pour mesurer liaison aux protéines plasmatiques, le dispositif RED a été utilisé dans plusieurs études de liaison de tissus en utilisant broyats. 10, 11 Dans ce protocole, on mesure la drogue se liant à caseum, les débris nécrotiques excisée des lésions nécrotiques et des cavités de lapins infectés par la tuberculose. Le acellulaire et la nature non-vasculaire caséeuse le rend facile à homogénéise en une suspension homogène qui est compatible avec le dosage.

Étant donné que caseum est fastidieux à produire et difficiles à trouver, le protocole a été validé pour une utilisation avec une matrice de substitution qui est préparé à partir de macrophages spumeux. macrophages dérivés de monocytes THP-1 sont induits par l'acide oléique pour accumuler plusieurs corps lipidiques qui leur donnent leur aspect « mousseuse ». Ces cellules chargées de lipides sont récoltées etTraité pour produire une matrice que nous utilisons comme substitut au caséum. Cette étude a montré que la liaison du médicament à cette matrice de substitution est bien corrélée à la liaison avec le caséum, imitant efficacement le processus in vivo qui entrave la pénétration du médicament dans le noyau caséo de granulomes et de cavités.

Protocol

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées conformément au Guide pour la prise en charge et l'utilisation des animaux de laboratoire des Instituts nationaux de santé avec l'approbation du Comité de soins et de soins pour animaux institutionnels du NIAID (NIH), Bethesda, MD. Toutes les études impliquant M. tuberculosis ont été effectuées dans un laboratoire avec un niveau de confinement de biosécurité 3 (BSL-3). 1. Modèle d'infection de lapin et coll…

Representative Results

À l'aide de ce protocole, nous avons testé des centaines de composés de développement de médicaments contre la tuberculose pour leur efficacité prédite à la casée pénétrante. La figure 1 permet de visualiser les concepts de base du dosage RED. La membrane de dialyse des inserts RED permet aux petites molécules non liées de se diffuser du puits du donneur au bien récepteur, atteignant finalement un équilibre entre les deux compartiments. Les petites mol…

Discussion

Les lésions et les cavités nécrotiques pulmonaires chez les patients infectés par la tuberculose contiennent des sous-populations de bactéries qui sont récalcitrantes au traitement médicamenteux. Les carottes caséoises de ces structures sont particulièrement responsables d'abriter ces persisters dans un environnement extracellulaire. 16 La répartition favorable des agents anti-bactériens dans ces endroits éloignés est considérée comme un déterminant important de l'efficaci…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous souhaitons remercier Johnson & Johnson, la TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X et Trius Therapeutics pour fournir bedaquiline, PA-824 (prétomanide), AZD5847, radezolid et tedizolid, respectivement. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li et Danielle Weiner ont soutenu l'analyse MALDI, les méthodes bioanalytiques, la préparation du substitut de la casum, la synthèse chimique et l'isolement de la casée de lapin. Ce travail a été mené avec le financement de la Fondation Bill et Melinda Gates, le prix # OPP1044966 et OPP1024050 à V. Dartois, Subvention d'instrumentation partagée NIH S10OD018072, ainsi que le financement conjoint de la Fondation Bill et Melinda Gates et Wellcome Trust pour un Centre d'excellence Pour l'optimisation du plomb pour les maladies du monde en développement à P. Wyatt.

Materials

New Zealand White Rabbits Covance
HN878 Mycobacterium tuberculosis BEI Resources NR-13647 
Ketathesia (Ketamine) 100mg/mL C3N Henry Schein Animal Health 56344
Anased (Xylazine) 100mg/mL Henry Schein Animal Health 33198
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution  Virbac 710101
THP-1 monocytic cell line ATCC ATCC TIB-202
175cm² TC-Treated Flask (T175) Fisher Scientific T-3400-175
RPMI 1640 media w/o glutamine Fisher Scientific MT-15-040-CV
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated  Fisher Scientific SH3091003IR
Hyclone L-glutamine, 200mM Fisher Scientific SH3003401
Cellstar TC dish, 145x20mm, vented Fisher Scientific T-2881-1
Phorbol 12-myristate13-acetate (PMA)  Fisher Scientific BP685-1
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma E6758
Oleic acid  Fisher Scientific ICN15178101
Pierce RED Device Reusable Base Plate Fisher Scientific PI-89811
Pierce RED Device Inserts, 50/box  Fisher Scientific PI-89809
Pierce RED insert removal tool  Fisher Scientific 89812
Adhesive plate seal Fisher Scientific 08-408-240
PBS, pH7.4, 10 X 500 mL (Gibco)  Life Technologies  10010-049
DMSO Sigma 472301
Acetonitrile Sigma 34998
Methanol Sigma 34860
Verapamil hydrochloride Sigma V4629
Diclofenac sodium salt Sigma 93484
Trypan Blue Solution, 0.4% Fisher Scientific 15-250-061
Ethanol, 200 proof Fisher Scientific 04-355-451
2010 Geno/Grinder SPEX SamplePrep 2010
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads Fisher Scientific 15-340-158
484R Cobalt 60 Irradiator JL Shepard 7810-484-1
INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers Fisher Scientific 22-600-100
Upright Light Microscope Leica DM1000
Binary Liquid Chromatography system Agilent 1260 Multi-compenent
Mass spectrometer AB Sciex 4000

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Sarathy, J. P., Liang, H. H., Weiner, D., Gonzales, J., Via, L. E., Dartois, V. An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. J. Vis. Exp. (123), e55559, doi:10.3791/55559 (2017).

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