En<em> In Vitro</em> Caseumbindningsanalys som förutspår läkemedelspenetration i tuberkulos-lesioner
Summary
Här beskrivs en snabb jämviktsdialys (RED) -metod för att mäta läkemedelsbindning till caseum från lung-tuberkulosskador och hålrum. Protokollet används också med en skummig makrofag-härledd matris som är en effektiv surrogat till kaseum.
Abstract
Utrotningen av tuberkulos sjukdom kräver läkemedelsregimer som kan tränga igenom de flera skikten av komplexa lungskador. Läkemedelsfördelning i fallhålorna i hålrum och lesioner är särskilt avgörande eftersom de hamnar subpopulationer av läkemedelstoleranta bakterier som också vanligen kallas persister. Befintliga metoder för mätning av läkemedelspenetration vid tuberkulosskador innebär kostsamma och tidskrävande farmakokinetiska studier in vivo kopplade till bioanalytiska eller bildtekniker. In vitro- mätningen av läkemedelsbindning till caseummakromolekyler föreslogs som ett alternativ till sådana tekniker eftersom denna bindning hindrar passiv diffusion av läkemedelsmolekyler genom caseum. Snabb jämviktsdialys är ett snabbt och pålitligt system för att utföra plasmaprotein och vävnadsbindningsstudier. I detta protokoll använde vi en snabb jämviktsdialys (RED) -enhet för att mäta läkemedelsbindning till homogenat av caseum som är excisEd från lesioner och håligheter hos tuberkulosinfekterade kaniner. Protokollet beskriver också hur man genererar en surrogatmatris från lipidladdade THP-1-makrofager för användning i stället för caseum. Denna caseum / surrogatbindningsanalys är ett viktigt verktyg vid upptäckt av tuberkulosläkemedel och kan anpassas för att hjälpa till att studera läkemedelsfördelning i lesioner eller abscesser orsakade av andra sjukdomar.
Introduction
Behandlingen av pulmonell tuberkulos sjukdom kräver effektiv distribution av läkemedel i olika typer av lesioner. Nekrotiska lesioner och håligheter innehåller fallhaltiga centra som hamnar subpopulationer av drogtoleranta eller "beständiga" bakterier. 1 , 2 Kavitetssjukdomen är förknippad med sämre härdningsgrader och dålig prognos. 3 , 4 Tidigare studier har visat, med hjälp av kvantitativa och bildtekniker, att förmågan att penetrera fallum varierar signifikant från en läkemedelsklass till en annan. 5 , 6 Dessa metoder kräver emellertid användning av djursinfektionsmodeller som är långsamma och tråkiga. En in vitro- analys som mäter läkemedelsbindning till ex vivo- caseum utformades. Denna bindning visade sig omvänt korrelera med läkemedelspenetration i fallhaltiga granulomer och är följaktligenAnvänds som ett prediktivt verktyg. 7
Ewilibrium dialys anses vara den standardiserade metoden för plasma-proteinbindningsstudier. Den snabba jämviktsdialysen (RED) -anordningen ger ett snabbt, lättanvänt och pålitligt system för att utföra sådana analyser. 8 Enheten består av två komponenter: engångsinlägg, engångsinsatser bestående av 2 kamrar separerade av en vertikal cylinder av halvpermeabelt membran; Och återanvändbara basplattor som kan rymma upp till 48 insatser åt gången. Dialysmembranet har en 8 kDa molekylvikt cut-off (MWCO) som är idealisk för läkemedels-makromolekylbindningsstudier. Det höga ytarea-till-volymförhållandet i membranfacket möjliggör snabb dialys och jämviktning. Både insatserna och bottenplattan har validerats för minimal icke-specifik bindning. Kombinationen av den röda enheten med bioanalytiska tekniker ger noggranna uppskattningar av de obundna fraktionerna av droger i pLasma. 8 , 9
Även om den ursprungligen utformades för att mäta plasmaproteinbindning, har den RÖDA anordningen använts i flera vävnadsbindande studier med användning av homogenat. 10 , 11 I detta protokoll mäter vi läkemedelsbindning till kaseum, de nekrotiska skräpen skars ut från de nekrotiska skadorna och håligheterna hos tuberkulosinfekterade kaniner. Den akellulära och icke-vaskulära naturen hos fallmaterialet gör det lätt att homogenisera till en homogen suspension som är kompatibel med analysen.
Med tanke på att caseum är tråkigt att producera och svårt att komma med, har protokollet också validerats för användning med en surrogatmatris som framställs från skumma makrofager. THP-1 monocyt-härledda makrofager induceras med oljesyra för att ackumulera multipla lipidkroppar som ger dem sitt "skumma" utseende. Dessa lipidbelastade celler skördas ochBearbetas för att producera en matris som vi använder som en surrogat till caseum. Denna studie har visat att läkemedelsbindning till denna surrogatmatris korrelerar väl med bindning till kaseum, vilket effektivt efterliknar in vivo- processen som hindrar läkemedelspenetration i fallös kärna av granulomer och kaviteter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lungnekrotiska lesioner och håligheter hos tuberkulosinfekterade patienter innehåller subpopuleringar av bakterier som är motstridiga mot läkemedelsbehandling. Fallkärnorna i dessa strukturer är särskilt ansvariga för att hysa dessa persister i en extracellulär miljö. 16 Gynnsam fördelning av antibakteriella medel i dessa avlägsna platser antas vara en viktig determinant av tuberkulosläkemedelseffektivitet. Före validering av detta protokoll fanns det inga tillgängliga in vitro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X och Trius Therapeutics för att tillhandahålla bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid respektive tedizolid. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li och Danielle Weiner tillhandahöll stöd med MALDI-analys, bioanalytiska metoder, beredning av caseum-surrogatet, kemisk syntes och isolering av kaninfall. Detta arbete utfördes med finansiering från Bill och Melinda Gates Foundation, pris # OPP1044966 och OPP1024050 till V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072, samt gemensam finansiering från Bill och Melinda Gates Foundation och Wellcome Trust för ett center of excellence För blyoptimering för sjukdomar i utvecklingsvärlden till P. Wyatt.
Materials
| New Zealand White Rabbits | Covance | – | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-glutamine, 200mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC dish, 145x20mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-myristate13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
| Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH7.4, 10 X 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
| Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
| Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
Riferimenti
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).
- Aber, V. R., Nunn, A. J. Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy. Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).
- Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells. Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Sarathy, J. P., et al. Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).
- Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding. J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).
- Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma. J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).
- Liu, X., et al. Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid. Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).
- Able, S. L., et al. Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat. Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).
- Via, L. E., et al. Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates. Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).
- Kalvass, J. C., Maurer, T. S. Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery. Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).
- Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis. J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).
- Lenaerts, A. J., et al. Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910. Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
