En 5-mC prikkblot-analyse Kvantifisering av DNA-metyleringsnivået av kondrocyt-diffusjon<em> I Vitro</em
Summary
Vi presenterer en metode for å kvantifisere DNA-metylering basert på 5-metylcytosin (5-mC) dot blot. Vi bestemte oss for 5-mC nivåene under chondrocyt dedifferentiering. Denne enkle teknikken kan brukes til å raskt bestemme kondrocytfenotypen ved ACI-behandling.
Abstract
Den dedifferentiering av hyalinkondrocytter til fibroblastiske kondrocytter følger ofte monolag-ekspansjon av kondrocytter in vitro . Det globale DNA-metyleringsnivået for kondrocyter anses å være en egnet biomarkør for tap av kondrocytfenotypen. Imidlertid kan resultater basert på forskjellige eksperimentelle metoder være inkonsekvente. Derfor er det viktig å etablere en presis, enkel og rask metode for å kvantifisere globale DNA-metyleringsnivåer under kondrocyt dedifferensiering.
Aktuelle genom-brede metyleringsanalyse teknikker bygger i stor grad på bisulfitt genomisk sekvensering. På grunn av DNA-nedbrytning under bisulfittomdannelse krever disse metodene typisk et stort prøvevolum. Andre metoder som brukes til å kvantifisere globale DNA-metyleringsnivåer inkluderer høyytelsesvæskekromatografi (HPLC). HPLC krever imidlertid fullstendig fordøyelse av genomisk DNA. I tillegg er forbudt høye kostnader for HPLC iStruments begrenser HPLCs bredere anvendelse.
I denne studien ble genomisk DNA (gDNA) ekstrahert fra humane kondrocyter dyrket med varierende antall passasjer. GDNA-metyleringsnivået ble detektert under anvendelse av en metyleringsspesifikk dot-blot-analyse. I denne dot blot-tilnærmingen ble en gDNA-blanding inneholdende det metylerte DNA som skal detekteres, spottet direkte på en N + -membran som en prikk inne i et tidligere tegnet sirkulært malemønster. Sammenlignet med andre gelelektroforese-baserte blotting-tilnærminger og andre komplekse blottingprosedyrer sparer dot blot-metoden betydelig tid. I tillegg kan dotblots detektere det totale DNA-metyleringsnivå ved bruk av et kommersielt tilgjengelig 5-mC antistoff. Vi fant at DNA-metyleringsnivået varierte mellom monolag-subkulturer, og kunne derfor spille en nøkkelrolle i kondondrocyt dedifferentiering. 5-mC dot blot er en pålitelig, enkel og rask metode for å oppdage det generelle DNA-metyleringsnivået for å evaluereE kondrocyt fenotype.
Introduction
Autolog chondrocytimplantasjon (ACI) er en relativt ny, state-of-the-art prosedyre for behandling av leddbruskdefekter 1 , 2 . En av de avgjørende trinnene i ACI er amplifisering av kondrocytter via monolagskultur in vitro . Under amplifisering, taper hyalinkondrocytterene lett sin fenotype og blir dedifferentiert, noe som er uønsket for ACI-behandling 3 , 4 . For å optimalisere utfallet av ACI-behandling, bør omfanget av kondrocyt dedifferentiering bestemmes før genplantning. Det er viktig å etablere en økonomisk og rask måte å bestemme kondrocytternes status på. Foreningen mellom DNA-metylering og kondrocyt dedifferentiering har nylig tiltrukket seg mye oppmerksomhet 4 , 5 , 6 . DNA-metylering er en prosess av whI metylgrupper tilsettes DNA, noe som resulterer i omdannelse av cytosinrester til 5-metylcytosin (5-mC).
For å belyse biologien av DNA-metylering i kondrocyt dedifferentiering, er det første trinnet å evaluere DNA-metyleringsnivået av kondrocytter, som hittil har vist seg å være utfordrende. Bisulfitt genomisk sekvensering er den mest brukte teknikken for å analysere DNA-metylering 7 , 8 . I denne analysen forårsaker bisulfitt-omdannelse DNA-nedbrytning, og således må det tilveiebringes en vesentlig mengde prøve for analysen. Dessuten har høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) blitt brukt til å kvantifisere globale DNA-metyleringsnivåer 9 , 10 . HPLC-analyse krever imidlertid genomisk DNA-fordøyelse. Videre kreves avanserte og dyre eksperimentelle instrumenter. Derfor, i tillegg til den høye prisen, er disse eksperimentelle prosedyrene tidsforstyrrelseruming. Anti-5-mC antistoffer har nå blitt kommersielt tilgjengelige, noe som har skapt muligheten for immunblotting av 5-mC-holdig genomisk DNA fra komplekse genomer.
I denne rapporten ekstrahente vi genomisk DNA fra kondrocyter dyrket i en serie av monolagskulturer. Vi brukte en dot blot-analyse for å evaluere 5-mC innholdet i humane kondrocyter med forskjellige antall passasjer. Vi fant at 5-mC innhold ble økt i svært dedifferentierte kondrocytter sammenlignet med kondrocytter med lavverdig dedifferentiering. I tillegg identifiserte vi et forhold mellom dedifferentiation status og 5-mC nivåer. Endelig rapporterte vi at endringene i 5-mC innhold var assosiert med kondrocyt fenotypen. Derfor er 5-mC dot blot-analysen en pålitelig, enkel og rask metode for å oppdage DNA-metyleringsnivået i kondrocytter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chondrocyt dedifferentiation in vitro kompromitterer svært utfallet av ACI i behandlingen av brusk defekt reparasjon 11 , 12 . For å optimalisere ACI-utfallet er det avgjørende å unngå bruk av dedifferentierte kondrocytter 13 . Studier har antydet at generelt DNA-metyleringsnivå er assosiert med omfanget av kondrocyt dedifferensiering 4 , 6 . Det er således avgjør…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd: Natural Science Foundation of China (nr. 81572198; nr. 81260161; nr. 81000460); Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr. 2015A030313772); Kina Postdoktoravhengighetsfond finansiert prosjekt (nr. 2013M530385); The Medical Research Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr. A2016314); Shenzhen Science and Technology Prosjekter (nr. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of |
| Ca2+/Mg2+ | |||
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Names | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Cell Strainer(40μm nylon） | FALCON Inc. | 352340 | |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
Riferimenti
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
