Un ensayo de transferencia de puntos de 5 mC cuantificando el nivel de metilación de ADN de la distredenciación de condrocitos<em> In Vitro</em
Summary
Se presenta un método para cuantificar la metilación del ADN basado en la 5-mctilcitosina (5-mC) dot blot. Se determinaron los niveles de 5-mC durante la desdiferenciación de condrocitos. Esta técnica simple podría utilizarse para determinar rápidamente el fenotipo de condrocito en el tratamiento de ACI.
Abstract
La desdiferenciación de condrocitos hialinos en condrocitos fibroblásticos acompaña a menudo la expansión monocapa de condrocitos in vitro . El nivel global de metilación del ADN de los condrocitos se considera un biomarcador adecuado para la pérdida del fenotipo de los condrocitos. Sin embargo, los resultados basados en diferentes métodos experimentales pueden ser inconsistentes. Por lo tanto, es importante establecer un método preciso, simple y rápido para cuantificar los niveles globales de metilación del ADN durante la desdiferenciación de los condrocitos.
Las técnicas actuales de análisis de metilación en todo el genoma se basan en gran medida en la secuenciación genómica del bisulfito. Debido a la degradación del ADN durante la conversión de bisulfito, estos métodos requieren típicamente un gran volumen de muestra. Otros métodos utilizados para cuantificar los niveles globales de metilación del ADN incluyen la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Sin embargo, la HPLC requiere digestión completa del ADN genómico. Además, el costo prohibitivo de la HPLC enLimita la aplicación más amplia de HPLC.
En este estudio, el ADN genómico (gDNA) se extrajo de condrocitos humanos cultivados con un número variable de pasajes. El nivel de metilación de gDNA se detectó usando un ensayo dot blot de metilación específica. En este enfoque dot blot, una mezcla de gDNA que contenía el ADN metilado a detectar se colocó directamente sobre una membrana N + como un punto dentro de un patrón de plantilla circular previamente dibujado. Comparado con otros enfoques basados en electroforesis en gel y otros procedimientos de transferencia de material complejos, el método dot blot ahorra tiempo significativo. Además, las manchas de puntos pueden detectar el nivel de metilación del ADN global usando un anticuerpo de 5 mC comercialmente disponible. Encontramos que el nivel de metilación del ADN difería entre los subcultivos monocapa, y por lo tanto podría desempeñar un papel clave en la desdiferenciación condrocitos. El punto blot de 5 mC es un método confiable, simple y rápido para detectar el nivel general de metilación del ADN a evaluarE fenotipo de condrocito.
Introduction
El implante autólogo de los condrocitos (IAC) es un procedimiento relativamente nuevo y de última generación para tratar los defectos del cartílago articular 1 , 2 . Uno de los pasos cruciales en ACI es la amplificación de condrocitos a través de cultivo monocapa in vitro . Durante la amplificación, los condrocitos hialinos pierden fácilmente su fenotipo y se desdiferencian, lo cual es indeseable para el tratamiento con ACI 3 , 4 . Para optimizar el resultado del tratamiento con ACI, se debe determinar la extensión de la desdiferenciación de los condrocitos antes de la replantación. Es imperativo establecer una manera económica y rápida de determinar el estatus de los condrocitos. Recientemente, la asociación entre la metilación del ADN y la desdiferenciación de los condrocitos ha atraído mucha atención 4 , 5 , 6 . La metilación del ADN es un proceso porLos grupos metilo se añaden al ADN, dando como resultado la conversión de residuos de citosina en 5-metilcitosina (5-mC).
Para dilucidar la biología de la metilación del ADN en la desdiferenciación de los condrocitos, el primer paso es evaluar el nivel de metilación del ADN de los condrocitos, que hasta ahora ha resultado difícil. La secuenciación genómica del bisulfito es la técnica más utilizada para analizar la metilación del ADN 7 , 8 . En este ensayo, la conversión de bisulfito causa la degradación del ADN, y por lo tanto se debe proporcionar una cantidad sustancial de muestra para el ensayo. Además, se ha utilizado la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para cuantificar los niveles globales de metilación del ADN 9 , 10 . Sin embargo, el análisis de HPLC requiere la digestión del ADN genómico. Además, se requieren instrumentos experimentales avanzados y costosos. Por lo tanto, además del alto costo, estos procedimientos experimentales son contra del tiempoUming Los anticuerpos anti-5-mC se han vuelto comercialmente disponibles, lo que ha creado la posibilidad de inmunotransferencia de ADN genómico que contiene 5 mC de genomas complejos.
En este informe, hemos extraído ADN genómico de los condrocitos cultivados en una serie de monocapas culturas. Se utilizó un ensayo dot blot para evaluar el contenido de 5 mC en los condrocitos humanos con diferentes números de pasajes. Se encontró que el contenido de 5-mC se incrementó en condrocitos altamente desdiferenciados en comparación con los condrocitos con desdiferenciación de bajo grado. Además, se identificó una relación entre el estado de desdiferenciación y los niveles de 5-mC. Finalmente, se informó de que los cambios en el contenido de 5-mC se asociaron con el fenotipo condrocito. Por lo tanto, el ensayo de transferencia de puntos de 5 mC es un método confiable, simple y rápido para detectar el nivel de metilación del ADN en los condrocitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desdiferenciación de condrocitos in vitro compromete gravemente el resultado de la ACI en el tratamiento de la reparación de defectos del cartílago [ 11 , 12] . Para optimizar el resultado ACI, es crucial evitar el uso de condrocitos desdiferenciados [ 13] . Los estudios han sugerido que el nivel general de metilación del ADN está asociado con la extensión de la desdiferenciación de los condrocitos 4</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones siguientes: Fundación de Ciencias Naturales de China (No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460); Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong, China (No. 2015A030313772); Proyecto financiado por la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (No. 2013M530385); La Fundación de Investigación Médica de la provincia de Guangdong, China (No. A2016314); Proyectos de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of |
| Ca2+/Mg2+ | |||
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Names | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Cell Strainer(40μm nylon） | FALCON Inc. | 352340 | |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
Riferimenti
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