framställning och<em> In Vitro</em> Karakterisering av Magnetized miR-modifierade endotelceller
Summary
Detta manuskript beskriver den effektiva, icke-viral avgivning av miR till endotelceller genom en PEI / MNP vektor och deras magnetisering. Sålunda, förutom att genetisk modifiering, tillåter detta tillvägagångssätt för magnetisk cell vägledning och MRI detekterbarhet. Tekniken kan användas för att förbättra egenskaperna hos terapeutiska cellprodukter.
Abstract
Hittills tillgängliga kirurgiska och farmakologiska behandlingar för hjärt- och kärlsjukdomar (CVD) är begränsade och ofta palliativ. På samma gång, gen- och cellterapi är mycket lovande alternativa tillvägagångssätt för CVD-behandling. Emellertid är bred klinisk tillämpning av genterapi kraftigt begränsad av bristen på lämpliga gen leveranssystem. Utveckling av lämpliga gentillförselvektorer kan ge en lösning på aktuella utmaningar i cellterapi. I synnerhet befintliga nackdelar, såsom begränsad effektivitet och låg retention cell i den skadade organet, kan övervinnas genom lämplig cellteknik (dvs genetiska) före transplantation. Den presenterade protokoll beskriver effektiv och säker övergående modifiering av endotelceller med användning av en polyetylenimin superparamagnetisk nanopartikel (PEI / MNP) -baserad leveransvektor. Dessutom är algoritmen och metoder för cellkarakterisering definierats. Den framgångsrika intracellular leverans av mikroRNA (MIR) i humana navelvenendotelceller (HUVEC) har uppnåtts utan att påverka cellviabilitet, funktionalitet, eller intercellulär kommunikation. Dessutom var detta tillvägagångssätt visat sig orsaka en stark funktionell effekt introducerade exogena miR. Viktigare, tillämpningen av denna MNP-baserad vektor säkerställer cell magnetisering, med åtföljande möjligheter till magnetisk inriktning och icke-invasiv MRI spårning. Detta kan utgöra en grund för magnetiskt styrda, genetiskt manipulerade cell terapeutika som kan övervakas icke-invasivt med MRI.
Introduction
Gen- och cellterapi är kraftfulla verktyg som har potential att lösa dagens utmaningar i CVD-behandling. Trots att båda dessa metoder för närvarande testas i kliniska prövningar, är de ännu inte redo för bred klinisk tillämpning 1. Noterbart är ett vanligt tillvägagångssätt för att ta itu med de utmaningar som gen- och cellterapi för att utveckla multifunktionella genlevererande vektorer som är lämpliga för klinisk tillämpning. Bristen på säkra och effektiva gentillförselsystem är det största problemet för genterapi. På samma gång, den genteknik av cellulära produkter före transplantation skulle kunna övervinna de allvarliga utmaningar som cellterapi, såsom låg effektivitet (t ex i hjärtområdet, uppnås endast ~ 5% av funktionell förbättring efter stamcellstransplantation 1 ) och dålig retention / engraftment vid stället för skada (dvs droppar cellkvarhållning under 5 – 10% inom några minuter till timmar post-tillämpning, oberoende av administrationsvägen 2, 3, 4).
Hittills, virala vektorer kraftigt överskrider de icke-virala system i termer av effektivitet, vilket har resulterat i en bredare tillämpning i kliniska prövningar (~ 67%) 5. Emellertid, virus fordon medför allvarliga risker, såsom immunogenicitet (och den efterföljande inflammatoriskt svar, med allvarliga komplikationer), onkogenicitet, och begränsningar i storleken på den burna genetiska materialet 6. På grund av dessa säkerhetsproblem och de höga kostnaderna för virusvektorproduktion, är att föredra i vissa fall 7, 8 användningen av icke-virala system. Det är särskilt lämplig för sjukdomar som kräver transient genetisk korrigering, såsom uttrycket av tillväxtfaktorer som kontrollerar angiogenes (t ex för CVD behandling) eller delivery av vacciner.
I vår grupp, var ett tillförselsystem utformad genom att kombinera grenpolyetylenimin 25-kDa (PEI) och superparamagnetiska järnoxidnanopartiklar (MNP) sammanbundna av biotin-streptavidin samspel 9. Denna vektor är ett potentiellt verktyg för genetisk manipulering av celler, vilket möjliggör deras samtidiga magnetisering före transplantation. Den senare ger en grund för magnetisk vägledning / retention, vilket är särskilt lovande nuförtiden, som avancerade magnetiska inriktningstekniker håller på att framgångsrikt utvecklat 10. Dessutom, de resulterande magnetiskt påverkbara celler har potentialen att vara icke-invasivt övervakas av magnetisk resonanstomografi (MRI) eller magnetisk partikel avbildning 11, 12.
I fallet med PEI / MNP-vektor, säkerställer polyamin nukleinsyra kondensation och därmed skydd mot nedbrytande faktor s, vektor internalisering i celler och endosomala fly 5. Den MNP komplettera egenskaperna hos PEI, inte bara i termer av magnetisk vägledning, men också genom att minska den kända PEI toxicitet 7, 13, 14. Tidigare var PEI / MNP vektor egenskaper justeras i termer av leveranseffektivitet (dvs., pDNA och miRNA) och säkerhet genom att använda fibroblaster och humana mesenkymala stamceller 15, 16.
I detta manuskript, är ett detaljerat protokoll om tillämpningen av PEI / MNP för alstringen av miRNA-modifierade celler beskrivna 17. För detta ändamål är HUVECs används och representerar en etablerad modell för in vitro-angiogenes. De är svårt att transfektera och är känsliga för giftiga påverkan 18, 19,ass = "xref"> 20. Dessutom tillhandahåller vi en algoritm för att utvärdera sådana celler in vitro, inklusive deras inriktning, intercellulär kommunikation, och MRI-detektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Produktion av genetiskt manipulerade celler laddade med superparamagnetiska nanopartiklar för deras ytterligare magnetiskt kontrollerad vägledning presenteras i det nuvarande protokollet. Framgångsrik tillämpning av denna strategi möjliggör upplösningen av vissa svårigheter av cellterapi, såsom låg retention och dålig engraftment i det skadade området 2, 3, 4, genom att tillhandahålla en inriktningsbar cellprodukt …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka G. Fulda (Electron Microscopy Centre, Rostock universitet, Tyskland) för teknisk support förvärva TEM-bilder av filtrerad supernanopartiklar och att utföra sina röntgenanalys. Det arbete som utförs på RTC Rostock stöddes av förbundsministeriet för utbildning och forskning Tyskland (FKZ 0312138A, FKZ 316.159 och VIP + 03VP00241) och staten Mecklenburg-Vorpommern med EU: s strukturfonder (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 och ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) och av DFG (DA 1296-1), Damp-Foundation, och den tyska Heart Foundation (F / 01/12). Frank Wiekhorst stöddes av EU FP7 forskningsprogrammet "NanoMag" FP7-NMP-2013-LARGE-7.
Materials
| PEI 25 kDa | Sigma Aldrich | 408727 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | Containing Sephadex G-25 Medium |
| Ninhydrin Reagent solution 2% | Sigma Aldrich | 7285 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| Microplate reader Model 680 | Bio-Rad | ||
| Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega | Z5481 | |
| Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45µm |
| Libra 120 transmission electron microscope | Zeiss | Acceleration Voltage 120KV | |
| Sapphire X-ray detector | EDAX-Amatek | ||
| Cell culture plastic | TPP | ||
| NHS-Esther Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-31 | |
| NHS-Esther Atto 488 | ATTO-TEC GmbH | AD 488-31 | |
| Cy5 miRNA Label IT kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
| Biotin Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
| Collagense Type IV Gibco | Thermo Scientific | 17104019 | |
| Endothelial growth medium, EGM-2 | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| anti-PECAM-1 antibody | Santa Cruz | sc-1506 | |
| MS MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Scientific | L10119 | |
| Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control | Thermo Scientific | AM17120 | "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript |
| Pre-miR miRNA Precursor Molecules – Negative Control | Thermo Scientific | AM17110 | "scr-miR" in the manuscript |
| Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor | Thermo Scientific | AM10916 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | 4% solution in PBS |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 | |
| NucleoSpin RNA isolation Kit | Machery-Nagel | 740955 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Scientific | AM1560 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4368814 | |
| hsa-miR-92a TaqMan assay | Thermo Scientific | 000431 | Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU |
| FastGene Taq Ready Mix | Nippon Genetics | LS27 | |
| ITGA5 TaqMan assay | Thermo Scientific | Hs01547673_m1 | |
| RNU6B TaqMan assay | Thermo Scientific | 001093 | |
| 18S rRNA Endogenous Control | Thermo Scientific | 4333760F | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | ||
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| 7.1 Tesla animal MRI system | Bruker Corporation | A7906 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH) | |
| MPS device | Bruker Biospin | ||
| Matlab software | Mathworks | ||
| Ring Neodym Magnet | magnets4you GmbH | RM-10x04x05-G | ø 10 mm; remanescence is ~1.3T, coercivity ≥ 955 kA/m |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Scientific | C10340 | |
| FluorSave Reagent | Merck | 345789 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin electronic | Type: RK 100 SH |
Riferimenti
- Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
- Zeng, L., Hu, Q., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
- Terrovitis, J., Lautamäki, R., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J Am Coll Cardiol. 54 (17), 1619-1626 (2009).
- Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy – Principles and Challenges. , (2015).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv Biomed Res. 1, 27 (2012).
- Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 15 (8), 541-555 (2014).
- Chira, S., Jackson, C. S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
- Li, W., Ma, N., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. J Gene Med. 10 (8), 897-909 (2008).
- Muthana, M., Kennerley, A. J., et al. Use of magnetic resonance targeting to direct cell therapy to target sites in vivo. Nat Commun. 6, 1-11 (2013).
- Zheng, B., von See, M. P., et al. Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation, Biodistribution, and Clearance of Stem Cells In Vivo. Theranostics. 6 (3), 291-301 (2016).
- Almstätter, I., Mykhaylyk, O., et al. Characterization of magnetic viral complexes for targeted delivery in oncology. Theranostics. 5 (7), 667-685 (2015).
- Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. , (2016).
- Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16023 (2016).
- Schade, A., Delyagina, E., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. Int J Mol Sci. 14 (6), 10710-10726 (2013).
- Delyagina, E., Schade, A., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), 999-1017 (2014).
- Voronina, N., Lemcke, H., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine. 12 (8), 2353-2364 (2016).
- Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
- Zhang, J., Wang, Z., Lin, W., Chen, S. Gene transfection in complex media using PCBMAEE-PCBMA copolymer with both hydrolytic and zwitterionic blocks. Biomaterials. 35 (27), 7909-7918 (2014).
- Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
- Moore, S., Stein, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J Biol Chem. 211 (2), 907-913 (1954).
- Jones, D. L., Owen, A. G., Farrar, J. F. Simple method to enable the high resolution determination of total free amino acids in soil solutions and soil extracts. Soil Biol Biochem. 34 (12), 1893-1902 (2002).
- Kircheis, R., Wightman, L., et al. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8 (1), 28-40 (2001).
- Green, N. M. A SPECTROPHOTOMETRIC ASSAY FOR AVIDIN AND BIOTIN BASED ON BINDING OF DYES BY AVIDIN. Biochem J. 94, 23 (1965).
- Haugland, R. P., You, W. W. Coupling of Antibodies with Biotin. Methods Mol Biol. 418, 13-23 (2008).
- Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. J Microbiol Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
- Andrade, &. #. 1. 9. 4. ;. L., Valente, M. A., Ferreira, J. M. F., Fabris, J. D. Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite. J Magn Magn Mater. 324 (10), 1753-1757 (2012).
- Barbaro, D., Di Bari, L., et al. Glucose-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles prepared by metal vapour synthesis are electively internalized in a pancreatic adenocarcinoma cell line expressing GLUT1 transporter. PLoS ONE. 10 (4), e0123159 (2015).
- Gaebel, R., Ma, N., et al. Patterning human stem cells and endothelial cells with laser printing for cardiac regeneration. Biomaterials. 32 (35), 9218-9230 (2011).
- Martín de Llano, J. J., Fuertes, G., Torró, I., García Vicent, C., Fayos, J. L., Lurbe, E. Birth weight and characteristics of endothelial and smooth muscle cell cultures from human umbilical cord vessels. J Transl Med. 7, 30 (2009).
- Bonauer, A., Carmona, G., et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science. 324 (5935), 1710-1713 (2009).
- Wang, W., Li, W., et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients. J Cell Mol Med. 15 (9), 1989-1998 (2011).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Cheng, K., Li, T. -. S., Malliaras, K., Davis, D. R., Zhang, Y., Marbán, E. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. , A.3B.1-A.3B.2 (2001).
- Chorny, M., Alferiev, I. S., et al. Formulation and in vitro characterization of composite biodegradable magnetic nanoparticles for magnetically guided cell delivery. Pharm Res. 29 (5), 1232-1241 (2012).
- Poller, W., Löwa, N., et al. Magnetic Particle Spectroscopy Reveals Dynamic Changes in the Magnetic Behavior of Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles During Cellular Uptake and Enables Determination of Cell-Labeling Efficacy. J Biomed Nanotechnol. 12 (2), 337-346 (2016).
- Lobsien, D., Dreyer, A. Y., Stroh, A., Boltze, J., Hoffmann, K. T. Imaging of VSOP Labeled Stem Cells in Agarose Phantoms with Susceptibility Weighted and T2* Weighted MR Imaging at 3T: Determination of the Detection Limit. PLoS ONE. 8 (5), 1-10 (2013).
- Hernando, D., Kühn, J. -. P., et al. R2* estimation using "in-phase" echoes in the presence of fat: the effects of complex spectrum of fat. J Magn Reson Imaging. 37 (3), 717-726 (2013).
- Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -. M., Parak, W. J., De Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6 (5), 446-465 (2011).
- Robert, D., Kirkton, N. B. Genetic Engineering and Stem Cells: Combinatorial Approaches for Cardiac Cell Therapy. IEEE Eng Med Biol Mag. 27 (3), 85 (2008).
- Chen, Y., Wang, W., et al. Development of an MRI-visible nonviral vector for siRNA delivery targeting gastric cancer. Int J Nanomedicine. 7, 359-368 (2012).
- Diener, Y., Jurk, M., et al. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep. 5, 17184 (2015).
- Müller, P., Voronina, N., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem Cells Int. 2016, 1-16 (2016).
- Yang, H., Vonk, L. A., et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells. Eur J Pharm Sci. 53, 35-44 (2014).
- Chen, C. -. H., Sereti, K. -. I., Wu, B. M., Ardehali, R. Translational aspects of cardiac cell therapy. J Cell Mol Med. 19 (8), 1757-1772 (2015).
- Alaiti, M. A., Ishikawa, M., et al. Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in ex vivo expanded CD34+ cells enhances cell-mediated angiogenesis. J Cell Mol Med. 16 (10), 2413-2421 (2012).
- Landázuri, N., Tong, S., et al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).
- Carenza, E., Barceló, V., et al. In vitro angiogenic performance and in vivo brain targeting of magnetized endothelial progenitor cells for neurorepair therapies. Nanomedicine. 10 (1), 225-234 (2014).
- Kyrtatos, P. G., Lehtolainen, P., et al. Magnetic Tagging Increases Delivery of Circulating Progenitors in Vascular Injury. JACC Cardiovasc Interv. 2 (8), 794-802 (2009).
- Huang, Z., Shen, Y., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149 (2013).
- Wu, X., Tan, Y., Mao, H., Zhang, M. Toxic effects of iron oxide nanoparticles on human umbilical vein endothelial cells. Int J Nanomedicine. 5, 385-399 (2010).
- Soenen, S. J. H., Nuytten, N., De Meyer, S. F., De Smedt, S. C., De Cuyper, M. High Intracellular Iron Oxide Nanoparticle Concentrations Affect Cellular Cytoskeleton and Focal Adhesion Kinase-Mediated Signaling. Small. 6 (7), 832-842 (2010).
- Cheng, K., Malliaras, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
- Vandergriff, A. C., Hensley, T. M., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
