通过光谱流式细胞仪由固态组织中分离出悬浮细胞系的分析
Summary
本文介绍的光谱仪，在流式细胞术中使用的发射光谱的形状来区分的荧光染料的新方法。算法替代补偿，可以把自动荧光作为一个独立的参数。这种新方法允许从实体器官分离的细胞的正确分析。
Abstract
流式细胞仪已被用于在过去40年来定义和分析淋巴细胞和其他造血细胞的表型。最初仅限于少数荧光染料的分析，目前有几十种不同的荧光染料，以及多达14-18不同的染料可以在同一时间内合并。然而，一些限制仍然影响的分析能力。因为荧光探针的多重性的，数据分析已经变得越来越复杂，因为需要的大，多参数的补偿矩阵。此外，携带荧光蛋白，以检测和跟踪在不同的组织的特定细胞类型的突变体小鼠模型已经变得可用，因此需要的分析（通过流式细胞术）从实体器官得到自体荧光的细胞悬液。光谱流式细胞仪，其沿宽范围连续波长区分的发射光谱的形状，解决一些上述问题。分析数据w ^第i个的算法代替补偿矩阵和治疗自体荧光作为一个独立的参数。因此，光谱流式细胞仪应该能够以类似的发射峰鉴别荧光的，并且可以提供一个多参数分析，而无需补偿要求。
该方案描述的光谱流式细胞分析，从而允许一个21参数（19个荧光探针）的表征和自动荧光信号的管理，提供在微小的人口检测高分辨率。这里的结果表明，光谱流式细胞术呈现细胞群从组织难以在以往的流量表征流式细胞术，如心脏和肠的分析的优点。光谱流式细胞仪从而表明高性能，而不要求流式细胞术常规流动补偿，使自发荧光管理的多参数分析能力。
Introduction
在过去的几十年中，流式细胞仪（FCM），成为细胞表型研究的一个必不可少的广泛使用的分析方法。出现了在可用的荧光染料的大幅增加，特别是荧光染料由紫色激光（405nm）的（ 例如，亮紫和新的Q点染料）激发。然而，现有的荧光染料的增长增加了重叠排放的风险和需要劳动密集型补偿矩阵。 FCM成为广泛用于分析从固体组织的细胞悬浮液，但自体荧光的细胞的存在限制特异性标记群的判别。
光谱FCM的基本原理被报告中详细二村等人。 1，2。简言之，此处所用的光谱FCM（见材料的表）配备有405，488，和638纳米的激光器。光谱捕获FCM所有散发氟luorescence如32通道线性阵列PMT（32CH PMT）500〜800nm的和，用于分别为420nm至440nm和450nm至469纳米，2个独立的光电倍增管，其取代传统的带通滤波器的光谱。 488个六百三十八分之四百零五nm激光光斑在空间上分离，而405nm和638 nm的激光斑点是共线的。对于每一个单独的颗粒中，光谱FCM措施达到由405nm的激发的荧光数据的66个信道和488个纳米激光器。当细胞通过638 nm激光激发，光谱测量FCM 58个通道的荧光数据的，因为掩模被插入以防止638 nm激光从照入PMT。光谱与FCM基于加权最小二乘法（WLSM），使荧光光谱重叠的分离的算法分析所获取的全光谱数据。从单染色和未染色的样品衍生的光谱，确认为基本参考光谱。多染色的样品被数学嵌合的ND未混合，并用混合荧光标记的样品的光谱被分解成其组成的光谱的集合。解混，在光谱技术3,4，替换，可以消除除了所述一个测量给定染料的所有检测器的信号中的补偿。
在这项研究中，我们结合并在一个单一的，21参数分析其特征在于，所述小鼠脾脏中发现的主要的造血子集进行测试19点的荧光染料。此外，我们证明了光谱仪可管理的自体荧光信号，从而改善肠道上皮内淋巴细胞和胚胎心脏的表征。事实上，在这些组织中，自发荧光管理允许特定荧光的细胞的分配，将在从常规FCM分析中排除。
Protocol
Representative Results
Discussion
常规FCM是基于检测的荧光探针的激励后发射的光子。在设计用于测量从另一荧光染料的信号的检测器检测到的一种荧光染料的荧光发射诱导物理重叠。发射光谱之间的这种溢出需要通过补偿进行校正。
光谱FCM和数据处理通过解混去卷积算法允许具有接近发射峰的荧光染料的无需额外补偿组合，条件是它们具有不同的光谱形状。用于分析的算法将自发荧光作为一个独立的参数?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们承认在K·富塔默拉，谁也批判校订手稿的光谱仪的技术和理论贡献。我们也感谢C.艾特·曼苏尔，P.-H. Commere，A班代拉和P.佩雷拉批判地阅读手稿和无尽的技术咨询和支持。我们也感谢P·佩雷拉为防Vγ7-APC和Vδ4生物素标记的抗体的礼物。我们aknowledge从巴斯德研究所的中心D'Enseignements的欢迎和支持拍摄物流。这项工作是由巴斯德研究所，研究所国家德拉桑特等德拉RECHERCHE MEDICALE（INSERM）的支持;瑞士国家科学基金会和巴斯德交易所鲁（SS）; Fundação第一个西恩西亚EA TECNOLOGIA – SFRH / BD /二千零十分之七万四千二百一十八（MV）;和巴黎大学狄德罗，法新社国立德拉RECHERCHE（ANR）项目Twothyme的ANR，并计划REVIVE（对于未来的投资）（AC）。
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
Riferimenti
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