הקמת מאגר ביולוגי המבוסס על מרפאה
Summary
גידולים עוריים נמחקים לעתים קרובות לאחר ניתוח microsraphic Mohs. פרוטוקול מתואר כאן המאפשר לצוות התמיכה הקלינית לעבד ולאחסן באופן יעיל גידול סרטני ( כגון קרצינומה של תאי קשקש , קרצינומה של תאי בסיס ומלנומה) עבור יישומים במעבדה במורד הזרם מבלי להפריע לפעולות קליניות.
Abstract
שכיחות סרטן העור ( למשל, קרצינומה של תאי קשקש , קרצינומה של תאי בסיס ומלנומה) גדלה בשנים האחרונות. צפוי כי תהיה דרישה מקבילה דגימות גידול סרטני למחקרים ביו-רפואיים. עם זאת, זמינות הרקמות מוגבלת בשל עלות הקמת מאגר ביולוגי וחוסר פרוטוקולים זמינים לקבלת דגימות קליניות שאינן מפריעות לפעולות קליניות. פרוטוקול הוקם כדי לאסוף ולעבד גידול עורית ודם הקשורים דגימות רוק שיש לו השפעה מינימלית על הליכים קליניים שגרתיים בתאריך של ניתוח Mohs. דגימות הגידול נאספות ומעובדות מחולים העוברים את השכבה הראשונה של ניתוח מוהס עבור ביופסיה מוכחת ממאירות עורית על ידי ההיסטולוג Mohs. רקמות נורמליות צמודות נאספות בזמן סגירת כירורגי. דגימות נוספות שניתן לאסוף הן כדוריות דם מלאות ובוקאליות. על ידי ניצול דגימות רקמות כי הם מושלכים בדרך כלל, biorepository נוצר המציע מספר יתרונות מרכזיים על ידי היותו מבוסס במרפאה לעומת הגדרת המעבדה. אלה כוללים מגוון רחב של דוגמאות שנאספו; גישה לרשומות המטופל, כולל דיווחי פתולוגיה; ו, עבור התורם טיפוסי, גישה דגימות נוספות במהלך הביקורים מעקב.
Introduction
מחקר סרטן וביו-מרקר מסתמך על אספקה של דגימות רקמות איכותיות, והאספקה המוגבלת הפריעה למחקר 1 , 2 . מחקרים רבים דרמטולוגים מוגבלים על ידי אספקה לקויה, איכות משתנה, ועלויות הקשורות לשימוש ברקמת האדם. העלות של הקמת ביובנק גדול ומוקדש נאמדה בכשני מיליון דולר 3 , ועלויות אלה מציבות את השימוש ברקמות אדם מחוץ להישג ידם של חוקרים רבים. יתר על כן, תהליך ייצור ואחסון של דגימות המחקר מהווה את הסיכון להשפיע על פעולות קליניות עיכוב הטיפול בחולה אם לא בוצע בזהירות. Biorepository עלות תועלת, המרפאה מבוסס הוקם כי מתמקדת דגימות סרטן העור בעקבות שיטות מומלצות המומלץ אימות מדגם 4 , 5 , 6 .
<p> פרוטוקול זה פותח במרפאת דרמטולוגיה שמבצעת נפח גדול של ניתוחים מיקרוסקופיים של מוה להסרת קרצינומה של תאי קשקש (SCC), קרצינומה של תאי בסיס (BCC) וסרטן עור מלנומה. ניתן לגייס תורמים מתנדבים מאוכלוסיית חולים זו. חשוב להקים את biorepository באתר של אוסף כדי ללכוד במהירות רקמות ודם מחולים מוסכם ללא עיכוב הטיפול. איסוף דגימות מאותה מרפאה ממזער וריאציות בטכניקות איסוף וממזער וריאציות באיכות דגימות, אשר יכול להיות בעייתי עבור יישומים במורד 7 , 8 .המטרה של טכניקת הניתוח microsraphic Mohs היא להבטיח כי כל רקמת הסרטן מוסר תוך שמירה על רקמה בריאה ככל האפשר. ההליך כולל הסרת פרוגרסיבי של שכבות דקות של רקמת הגידול. כל שכבה עוקבת הוא שלוכדי לבדוק בצורה לוגית (לאחר cryosectioning רקמת הגידול וביצוע מכתים H & E) על ידי רופא עור כדי לקבוע אם כל רקמת הסרטן הוסר. כריתה ובדיקה של שכבות של רקמות לאחר מכן מבוצע בזמן שהחולה נשאר במשרד. טכניקה זו נחשבת האפשרות הטיפול הטוב ביותר עבור SCC 9 . בשלב זה, הפצע סגור, כדי לשפר את הריפוי ואת המראה הקוסמטי, רקמה רגילה הסמוך (ANT) הוא נכרת לעתים קרובות. לפיכך, הליך כירורגי זה כדי להסיר גידול מתאים באופן אידיאלי עבור איסוף רקמות מאופיינות היסטולוגית עבור מחקרים עתידיים.
ההליך רכש להשגת רקמת הגידול, רקמה רגילה, רוק, דגימות דם ו תוכנן להיות בעל השפעה מינימלית על צוות העובדים הרגילים ( איור 1 ). עוזרים רפואיים לבצע את הדם שואבת בעת הכנת החולה עבור ההליך. לאחר השלמת הליך מוס, M Ohs histotechnologist מכין שקופיות היסטולוגית נוספת של הדגימה ומעביר את הרקמה למחסן biorepository. עלויות הקשורות בהקמת biorepository כוללים רכישת מקפיאים cryopreservation, יצירת מרחב מעבדה קליני צנוע, ופיתוח של תוכנית מעקב מלאי.
איור 1: רצף איסוף מדגם וצוות אחראי. לאחר ביצוע הצ'ק-אין של המטופל והשלמת הסכמת החולה, עוזר הרפואי אוספת מטלית חזה ומבצע משיכת דם. רופא העור ועוזר רפואי אז לבלו את הגידול ולסגור את הפצע, שבמהלכם זמן SCC ו דגימות ANT נאספים, בהתאמה. טכנאי מעבדה ייעודי מעבד את הדם ואת החלקים SCC ו- ANT דגימות לתרבות רקמות, שימור, וכניסה לתוך biorepository."לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו." Target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות זו.
מגוון הדגימות שנאספו מאפשר מגוון של גישות ניסיוניות ( איור 2 ). הדגימות שנאספו מהחולה הן ספוגי buccal (רוק יכול גם להיות שנאסף במידת הצורך), דם שלם, ורקמות ננטשים. את bubal swabs ו מדגם של כל הדם נשמרים, ללא עיבוד, עבור genotyping ו התאמת רקמות. כל הדם מופרד לתאי דם לבנים (WBC) ושברי פלזמה לניתוחים עתידיים. לאחר עיבוד Mohs, הגידול הקפוא ממוקם ישירות לתוך חנקן נוזלי הועבר מקפיא -80 מעלות צלזיוס. טריים, רקמת גידול קיימא דגימות ANT הם מתורבתים באמצעות שינויים של טכניקות קודמות 10 , 11 ולאחר מכן cryopreserved. במהלך האוסף, מספר כל סוג מדגם נרשם בגיליון אלקטרוני לפני הכניסה את תוכנית מעקב מלאי כדי להקל על עיבוד מדויק ( טבלה 1 ).
איור 2: מתאר של המרפאה מבוסס biorepository אוסף המדגם ועיבוד. מטלית buccal ו דגימת דם נאספים מן המטופל ומאוחסנים עבור genotyping במורד הזרם ואת התאמת רקמות. דם שלם מעובד עוד יותר לבדיקת תאי דם לבנים (WBC) וניתוח CTC, וכן לאיסוף פלזמה ולניתוח ביופסיה נוזלית. רקמות שנחקרו במהלך ההליך Mohs מעובד היסטולוגית למטרות אבחון, ולאחר מכן את שקופיות היסטולוגית ניתן להשתמש באופן ניסיוני עבור ניתוחים immunohistochemical נוסף. בתנאי מדגם הרקמה שנחקרו הוא גדול מספיק, חלק רקמות טריות מוסר וחתך לבידוד חלבון RNA, וכן להקמת שורות תאים תרבותיים.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| תאריך איסוף: | |||||
| מטופל 1 | מטופל 2 | מטופל 3 | מטופל 4 | מטופל 5 | |
| תאריך לידה ותאריך לידה | |||||
| צבע עיניים | |||||
| סוג דוגמה | |||||
| מיקום לדוגמה | |||||
| רוֹק | |||||
| Wחור דם | |||||
| פְּלַסמָה | |||||
| גידול בר קיימא | |||||
| רקמות רגיל בר קיימא | |||||
| גידול חנקן נוזלי | |||||
| רקמות רגילות חנקן נוזלי | |||||
| שקופיות |
טבלה 1: רשימת פעולות לביצוע כדי לרשום אוספי מדגם. הנתונים שנחקרו ונרשמו עם כל דגימה שנאספו כוללים ראשי תיבות של המטופל, תאריך הלידה וצבע העין (עבור הקלדת עור), כמו גם את locatiעל הסרת הדגימה. מספר דגימות הרוק, כמויות איסוף הדם, ומספר הדגימות של הרקמה המשומרת והמשומרת, נרשמות גם כהפניות להקצאות לשימושים מאוחרים יותר. לחץ כאן להורדת הקובץ.
כדי לאמת את נהלי איסוף המדגם, כל סוג מדגם נבדק ביישומים במורד הזרם. באמצעות שינויים של טכניקות קודמות 12 , הגידול ANT שימשו בהצלחה בבידוד חלבון ו- RNA והוא יכול לשמש לבידוד דנ"א. אקספלנסים קיימא הוקמה מתוך קטעי רקמה הוערכו על ידי מיקרוסקופ, בעוד שקופיות היסטולוגית מאוחסנים שימשו אימונוהיסטוכימיה ו immunofluorescence.
על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר כאן, ניתן להרחיב את המודל הזה למרפאות דרמטולוגיה אחרות, סוגי גידול אחרים (כגון מלנומה), וכן התמחויות כירורגיות אחרות כדי לספק דגימות רקמות האדם למחקר רב פנים לתוך סרטן האדם. שינויים קלים של פרוטוקול זה צפויים להיות נחוצים עבור שיטות אחרות, אבל, באופן עקרוני, פרוטוקול זה הוא ישים לכל תרגול כירורגי כי באופן שגרתי משליך דגימות החולה שנאספו במהלך הטיפול בחולה.
Protocol
Representative Results
Discussion
לדעת המחבר, פרוטוקול זה הוא הראשון מסוגו המתמקד הרכש הקליני של דגימות רקמה עורית הן בגישה מהירה וחסכונית. מטופלים העוברים ניתוח מיקרוסקופיים במוס מתוכננים בדרך כלל במהלך גושי זמן ספציפיים, והאוסף מוגבל לתקופות אלה. אוסף הדגימה כרוך במאמץ של עוזר רפואי המעורב בטיפול …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי כספים מן המערב התיכון אוניברסיטת מכללת למדעי הבריאות מחקר מענק סיוע, הוענק EEH, ו Midwestern אוניברסיטת מחקר של מחקר תוכניות ממומן גרנט פנימי, הוענק KJL. תמיכה נוספת סופקה על ידי מעבדות קשורות ודרמטולוגיה. אנו מודים שרה Potekhen, ג'יימי בארטו, סטפני פאוקס, קודי Jording, Stacie Schimke, הת 'ר Kissel, עלי Zaidi על סיוע טכני שלהם.
Materials
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA | ThermoFisher Scientific | 02-685-2B | |
| Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades | ThermoFisher Scientific | 50-949-411 | |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | ThermoFisher Scientific | 16-100-110 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-138 | |
| Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium | ThermoFisher Scientific | NC9791321 | |
| Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound | ThermoFisher Scientific | 50-363-579 | |
| Leica CM1950 Cryostat | Leica Biosystems | 14047743909 | |
| Frosted Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-343 | |
| Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 99-900-01 | |
| Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes | ThermoFisher Scientific | 03-337-7X | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| Boca Scientific BuccalT-Swab | ThermoFisher Scientific | NC9679349 | |
| Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer | ThermoFisher Scientific | 50-195-822 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | PI78443 | |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 05-401-203 | |
| Pellet Morter Cordless Homogenizer | ThermoFisher Scientific | 12-141-3 | |
| RNAse Free Pellet Pestle | ThermoFisher Scientific | 121-141-364 | |
| Forma SteriCycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 13-998-089 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | SH30071.02 | |
| Gibco Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12-634-028 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140148 | |
| Gibco 1M Hepes | ThermoFisher Scientific | 15-630-130 | |
| Nunc Cell Culture 35 mm with Vent | ThermoFisher Scientific | 1256591 | |
| Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 | Abnova | MAB12583 | |
| Anti-p40 (p63 delta) antibody | Abnova | ABX-144A | |
| Anti MUC-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-7313 | |
| Anti-Snail + Slug (phospho S246) | Abcam | Ab63568 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 568 Phallodin | Molecular Probes | A12380 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P36941 | |
| Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera | Zeiss | 4300009901 | |
| Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera | Olympus | IX511F3 |
Riferimenti
- Baker, M. Biorepositories: Building better biobanks. Nature. 486, 141-146 (2012).
- Ambrosone, C. B., Nesline, M. K., Davis, W. Establishing a cancer center data bank and biorepository for multidisciplinary research. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15, 1575-1577 (2006).
- Baird, P. M., Gunter, E. W., Vaught, J. Building a biobank. Biopreserv Biobank. 14, 87-88 (2016).
- Caixeiro, N. J., Lai, K., Lee, C. S. Quality assessment and preservation of RNA from biobank tissue specimens: a systematic review. J Clin Pathol. 69, 260-265 (2016).
- Campbell, L. D., et al. Development of the ISBER best practices for repositories: Collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research. Biopreserv Biobank. 10, 232-233 (2012).
- Neumeister, V. M. Tools to assess tissue quality. Clin Biochem. 47, 280-287 (2014).
- Vaught, J., et al. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J Natl Cancer Inst Monogr. 2011, 1-7 (2011).
- Fu, T., Aasi, S. Z., Hollmig, S. T. Management of high-risk squamous cell carcinoma of the skin. Curr Treat Options Oncol. 17, (2016).
- Rasmussen, C., Thomas-Virnig, C., Allen-Hoffmann, B. L. Classical human epidermal keratinocyte cell culture. Methods Mol Biol. 945, 161-175 (2013).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Cancer cell culture: Methods and protocols. , 151-159 (2011).
- Berglund, S. R., Schwietert, C. W., Jones, A. A., Stern, R. L., Lehman, J., Goldberg, Z. Optimized methodology for sequential extraction of RNA and protein from small human skin biopsies. J Invest Dermatol. 127, 349-353 (2007).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 1-14 (2006).
- Cooper, H. L., et al. Expression and glycosylation of MUC1 in epidermolysis bullosa-associated and sporadic cutaneous squamous cell carcinomas. Br J Dermatol. 151, 540-545 (2004).
- Riihila, P. M., et al. Complement factor H: a biomarker for progression of cutaneous squamous cell carcinoma. J Invest Dermatol. 134, 498-506 (2014).
- Ha Lan, T. T., et al. Expression of the p40 isoform of p63 has high specificity for cutaneous sarcomatoid squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 831-838 (2014).
- Alomari, A. K., Glusac, E. J., McNiff, J. M. p40 is a more specific marker than p63 for cutaneous poorly differentiated squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 839-845 (2014).
- Qiao, B., Johnson, N. W., Gao, J. Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factor-beta1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and -9 expressions. Int J Oncol. 37, 663-668 (2010).
- Vaught, J. Developments in biospecimen research. Br Med Bull. 114, 29-38 (2015).
