Forberedelse og karakterisering av nye HDL-imiterende nanopartikler for nervvekstfaktorkapsling
Summary
Enkel homogenisering ble brukt til å forberede nye, høyt tetthet, lipoprotein-imiterende nanopartikler for å inkapslere nervevækstfaktoren. Utfordringer, detaljerte protokoller for fremstilling av nanopartikler, in vitro karakterisering og in vivo- studier er beskrevet i denne artikkelen.
Abstract
Formålet med denne artikkelen er å introdusere preparerings- og karakteriseringsmetoder for nervepolymer (NGF) -belastede, høyt tetthet, lipoprotein (HDL) -mimicking nanopartikler (NP). HDL er endogene NP og har blitt utforsket som kjøretøy for levering av terapeutiske midler. Ulike metoder har blitt utviklet for å fremstille HDL-imiterende NP'er. Imidlertid er de generelt kompliserte, tidkrevende og vanskelige for industriell oppskalering. I denne studien ble en-trinns homogenisering brukt til å blande hjelpestoffene og danne prototypen NP. NGF er et vannløselig protein på 26 kDa. For å lette innkapslingen av NGF i lipidmiljøet for HDL-imiterende NP'er ble protamin USP brukt til å danne et ion-pair-kompleks med NGF for å nøytralisere ladningene på NGF-overflaten. NGF / protaminkomplekset ble deretter introdusert i prototypen NPs. Apolipoprotein Al ble endelig belagt på overflaten av NPene. NGF HDL-imiterende NP viste foretrukne egenskaper i termenS med partikkelstørrelse, størrelsesfordeling, innfestingseffektivitet, in vitro- frigivelse, bioaktivitet og biodistribusjon. Med forsiktig utforming og utforskning av homogenisering i HDL-imiterende NP, ble prosedyren forenklet, og NPene ble gjort skalerbare. Dessuten ble ulike utfordringer, som å separere losset NGF fra NP, gjennomført pålitelige in vitro frigivelsesstudier, og måling av bioaktiviteten til NPene, overvunnet.
Introduction
Makromolekyler, som proteiner, peptider og nukleinsyrer, har kommet fram som lovende medisiner og har fått stor oppmerksomhet i de siste tiårene 1 , 2 . På grunn av deres høye effekt og spesifikke virkemåter, utviser de gode terapeutiske muligheter for behandling av kreft, immunforsvar, hiv og relaterte tilstander 3 , 4 . Imidlertid gjør fysiokjemiske egenskaper, som deres store molekylære størrelse, tredimensjonale struktur, overfladeladder og hydrofil natur, in vivo- tilførsel av disse makromolekylene svært utfordrende. Dette hindrer betydelig klinisk bruk 4 . Nylige fremskritt i legemiddelleveringssystemer, slik som mikropartikler, polymer nanopartikler (NP), liposomer og lipid-NP, overviste disse utfordringene og forbedret in vivo- leveransen av makromolekyler. HoWever, noen ulemper med hensyn til disse leveringslastene, har blitt avdekket, inkludert lavt legemiddelbelastningsevne, lav innfestingseffektivitet, kort halveringstid, tap av bioaktivitet og uønskede bivirkninger 5 , 6 , 7 , 8 . Effektive bæresystemer forblir et område med forskningsinteresse. Videre er utviklingen av analytiske metoder for å karakterisere narkotikaplastede NPe mer utfordrende for makromolekyler enn for små molekyler.
High-density lipoprotein (HDL) er en naturlig NP sammensatt av en lipidkjerne som er belagt av apolipoproteiner og et fosfolipidmonolag. Endogen HDL spiller en kritisk rolle i transporten av lipider, proteiner og nukleinsyrer gjennom samspillet med målreseptorer, som SR-BI, ABCAI og ABCG1. Det har blitt utforsket som et kjøretøy for levering av forskjellige terapeutiske midler 9, 10 , 11 , 12 . Ulike metoder har blitt utviklet for å fremstille HDL-imiterende NP'er. Dialyse er en populær tilnærming. I denne metoden dannes NPer ved hydrering av en lipidfilm under anvendelse av natriumkolatløsning. Saltet fjernes deretter gjennom en 2-dagers dialyse med tre buffere 13 . Sonikasjonsmetoder fremstiller NP ved å sonikere en lipidblanding i 60 minutter under en oppvarmningsbetingelse; NPene renses videre ved gelkromatografi 14 . Mikrofluidika genererer NPer via en mikrofluidisk enhet som blander fosfolipider og apolipoprotein AI (Apo AI) -løsninger ved å lage mikrovorter i et fokuseringsmønster 15 . Klart, disse metodene kan være tidkrevende, hard og vanskelig for industriell oppskalering.
I denne artikkelen presenterer vi utarbeidelsen og karakteriseringen av nye HDL-mimicking NPs for nerveVekstfaktor (NGF) innkapsling. NGF er en disulfid-koblet polypeptid-homodimer inneholdende to 13,6-kDa polypeptidmonomerer. En ny fremgangsmåte for å fremstille NPene ved homogenisering, etterfulgt av innkapslingen av NGF i NP, ble utviklet. NGF HDL-imiterende NP ble karakterisert for partikkelstørrelse, størrelsesfordeling, zeta potensial og in vitro frigjøring. Deres bioaktivitet ble evaluert for neurittutvækst i PC12-celler. Biodistribusjonen av NGF HDL-imiterende NP ble sammenlignet med den for fri NGF etter intravenøs injeksjon i mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien demonstrerer vi en enkel metode for å forberede HDL-imiterende NP til NGF-innkapsling. Ulike NP-leveringssystemer har blitt studert for å levere proteiner. For tiden involverer mange NP-preparater dialyse, løsningsmiddelfelling og filmhydratisering. Disse prosessene er generelt kompliserte og utfordrende ved oppskalering. Under denne NP-utviklingen ble det bestemt at lipidene hadde sterk adhesjon til glassveggen i beholderen, noe som førte til vanskelighetene ved hydratisering av tynnfilmen og effekt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH R03 NS087322-01 til Dong, X.
Materials
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-a-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1mg in 671 µl 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
References
- Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
- Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).
- Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle. Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).
- Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K. Long-term delivery of protein therapeutics. Expert Opin Drug Deliv. 12 (3), 415-440 (2015).
- Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. . Medical application of liposomes. , (1998).
- Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).
- Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate. J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).
- Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles. Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).
- Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. High-density lipoproteins: nature’s multifunctional nanoparticles. ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).
- Gursky, O. Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).
- McMahon, K. M., Thaxton, C. S. High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).
- McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy. Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).
- Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications. Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).
- Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting. Small. 6 (3), 430-437 (2010).
- Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics. ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).
- Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution. Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).
