Ablazione chirurgica Assay per lo studio degli occhi Rigenerazione in Planarie

Summary

Questo protocollo mostra come ad accisa in modo coerente gli occhi planaria (tazze ottica) senza disturbare i tessuti circostanti. L'utilizzo di un ago da insulina e la siringa, uno o entrambi gli occhi possono essere ablato per facilitare le indagini i meccanismi che regolano la rigenerazione degli occhi, l'evoluzione della rigenerazione visiva, e le basi neurali del comportamento indotto dalla luce.

Abstract

Nello studio di cellule staminali adulte e meccanismi rigenerativi, platelminti planarian sono una graffetta nel sistema modello in vivo. Ciò è dovuto in gran parte alla loro abbondante popolazione di cellule staminali pluripotenti e la capacità di rigenerare tutti i tipi di cellule e tessuti dopo lesioni che sarebbe catastrofico per la maggior parte degli animali. Recentemente, planarie hanno guadagnato popolarità come modello per la rigenerazione degli occhi. La loro capacità di rigenerare l'intero occhio (composto da due tipi di tessuto: cellule pigmento e fotorecettori) consente la dissezione dei meccanismi che regolano la rigenerazione del sistema visivo. ablazione occhio ha diversi vantaggi rispetto ad altre tecniche (come decapitazione o fori) per l'esame percorsi e meccanismi specifici occhio, il più importante dei quali è che la rigenerazione è in gran parte limitato ai soli tessuti dell'occhio. Lo scopo di questo articolo il video è quello di dimostrare come rimuovere in modo affidabile la coppa ottica planarian senza disturbare il cervello o tessuti circostanti.Movimentazione di vermi e manutenzione di una colonia stabilita viene anche descritto. Questa tecnica utilizza un 31 G, ago da insulina da 5/16 pollici per raccogliere chirurgicamente la coppa ottica di planarians immobilizzati su un piatto freddo. Questo metodo comprende sia singola e doppia ablazione dell'occhio, con gli occhi rigeneranti entro 1-2 settimane, consentendo una vasta gamma di applicazioni. In particolare, questa tecnica di ablazione può essere facilmente combinato con (RNA interference) schermi farmacologici e genetici per una migliore comprensione dei meccanismi rigenerativi e loro evoluzione, cellule staminali occhio e la loro manutenzione e risposte comportamentali phototaxic e la loro base neurologica.

Introduction

Planarie sono un potente organismo modello per studiare la rigenerazione cellulare mediata staminali adulte. Questi platelminti acqua dolce non parassitarie possiedono la capacità di rigenerare qualsiasi e tutti i tessuti mancanti, tra loro sistema nervoso centrale e del cervello ^1. Studiata fin 1700 ^2, progressi tecnologici nel campo planarian corso degli ultimi 10-15 anni (quali un genoma sequenziato, ibridazione in situ, immunoistochimica, interferenza RNA (RNAi), e trascrittomica) hanno aggiornato questo organismo modello storico . In particolare, planarie hanno recentemente guadagnato la popolarità come un modello emergente per la ricerca degli occhi ^3.

Planarians hanno occhi prototipici con solo due tipi di tessuto, i neuroni fotorecettori e cellule pigmentate; ciò ha permesso la caratterizzazione della sua popolazione dell'occhio cellule staminali e dimostrato che molti degli stessi geni che regolano vertebrato occhio deluppo sono conservati in planarians ^{4, 5.} Le coppe ottiche si trovano dorsalmente e comprende il bianco, dendriti dei neuroni non pigmentate fotorecettori e le cellule del pigmento nero semi-lunari, e gli occhi innervano il cervello attraverso un chiasma ottico. Oltre ad essere un modello per chiarire processi rigenerativi ^6, l'occhio planarian è adatto per studiare l'evoluzione dei meccanismi visivi ^7, risposte comportamentali alla luce (planarians visualizzare fototassi negativo) ^8, e la base neurologiche del comportamento ^9.

Rigenerazione oculare planarians è stato ampiamente studiato in due contesti principali: come parte della rigenerazione testa dopo decapitazione ^{4, 10,} e dopo l'asportazione di soli tessuti oculari ^{11, 12} </sup>. La maggior parte degli studi sulla rigenerazione planaria occhi hanno usato il metodo di decapitazione, in quanto è semplice e lineare. Il metodo escissione occhio planarian più comune è stato finora tramite perforazione con un tubo capillare vetro sottile ^{13, 14,} anche se alcuni studi hanno anche eseguito amputazioni appena dietro gli occhi (decapitazione parziale) ^15. Tuttavia, tutti questi metodi comportano la perdita di molti tessuti diversi solo l'occhio (come il cervello, intestino, e nefridi), potenzialmente complicando l'interpretazione dei risultati. Il protocollo ablazione occhio qui presentata limita escissione ai tessuti dell'occhio (escludendo in particolare del cervello), con conseguente dati che sono più specifici per l'occhio. Inoltre, a differenza di vermi decapitati che prendono 7-14 giorni per iniziare l'alimentazione, occhio ablato vermi alimentare entro 24 h di ablazione ^12, consentendo esperimenti RNAi (dove RNAi viene fornita mediante il cibo) da esibiràd contemporaneamente.

Anche se l'ablazione occhio è tecnicamente più difficile da eseguire con successo di decapitazione, gli studi in corso sulla escissione occhio non hanno incluso le istruzioni dettagliate sulle loro procedure. L'obiettivo di questo articolo il video è quello di consentire ai ricercatori di rimuovere costantemente la coppa ottica planaria senza disturbare i tessuti cerebrali sottostanti e la rimozione come pochi altri tessuti come possibile. Questo metodo può essere utilizzato sia per singolo e doppio ablazione dell'occhio ed è applicabile ad una vasta gamma di indagini. Come la maggior parte dosaggi di rigenerazione, l'ablazione occhio è adatto per la combinazione con entrambi (RNAi) schermi farmacologiche e genetiche, così come studi comportamentali. Qui si descrivono i metodi per la gestione di vermi, il mantenimento di una colonia planaria, e la tecnica di ablazione occhio stesso.

Protocol

1. Cultura e trattamento degli animali NOTA: Questo protocollo utilizza mediterranea Schmidtea, una specie planaria diploide con un genoma sequenziato 16, 17 che viene comunemente utilizzato per la ricerca di rigenerazione. Tuttavia, l'analisi è altrettanto successo con altre specie, quali Girardia tigrina e Girardia dorotocephala (che sono disponibili in commercio). Mantenere vermi …

Representative Results

Per la prima post chirurgia 1-2 h, animali possono esibire movimento è diminuito rispetto ai vermi intatti (tuttavia essi sposteranno comunque). Se lo si desidera, vermi mangiare entro 24 ore di chirurgia (per esempio, per l'alimentazione RNAi). Quando si segue la rigenerazione degli occhi negli stessi individui nel corso del tempo, assicuratevi di prendere una fotografia di ciascuna vite senza fine sia prima dell'intervento chirurgico (intatto) e al 1 ore dopo l'ablazione (…

Discussion

Questa tecnica di ablazione dell'occhio migliora la metodologia correnti (come fori) escludendo tessuti cerebrali e limitando escissione principalmente ai tessuti oculari. Con la pratica, questa tecnica può essere eseguita dalla maggior parte degli individui, da tecnici esperti in microchirurgia per studenti universitari inesperti ma di coscienza. Si raccomanda che questa tecnica essere praticato molte volte prima di utilizzare ablazioni in esperimenti, inclusi (quando possibile) conferma della rimozione completa d…

Materials

Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional