수술 절제 분석 플라나리아에 아이 재생을 유학을위한
Summary
이 프로토콜은 지속적으로 주변 조직을 방해하지 않고 플라나리아의 눈 (광학 컵)을 절제하는 방법을 보여줍니다. 어느 하나의 인슐린 바늘 및 주사기를 사용 또는 양쪽 눈은 눈의 재생, 영상 재생의 진화, 및 광 – 유도 행동 신경 기초 규제기구에 조사를 용이하게 절제 할 수있다.
Abstract
성체 줄기 세포 및 재생 메커니즘의 연구에서, 플라나리아 편형 동물은 생체 내 모델 시스템의 주식입니다. 이것은 그들의 풍부한 만능 줄기 세포 인구와 대부분의 동물에 대한 재앙이 될 것입니다 부상 후 모든 세포와 조직 유형을 재생하는 능력에 상당 부분 기인한다. 최근, 플라나리아는 눈 재생의 모델로 인기를 얻고있다. (두 조직 유형으로 구성 : 색소 세포 감광체) 전체에 눈을 재생하는 능력이 재생 시각 시스템을 조절 메커니즘의 절개 허용한다. 눈 박리는 재생 만 크게 눈 조직에 한정된다 가장 중요한있는 눈 특정 경로 및 메커니즘을 조사하는 (예 잘린 또는 펀치 구멍 등의) 다른 기술에 비해 몇 가지 장점이있다. 이 비디오 문서의 목적은 확실하게 뇌를 방해하거나 주변 조직없이 플라나리아 광학 컵을 제거하는 방법을 설명하는 것입니다.웜 확립 콜로니의 유지 보수 처리도 설명된다. 이 기술은 수술 콜드 플레이트에 고정화 플라나리아의 광학 컵을 특종 31 G, 16분의 5 인치 인슐린 바늘을 이용한다. 이 방법은 다양한 애플리케이션을 가능하게 1 ~ 2 주 이내에 재생 눈으로, 단일 및 이중 눈 절제를 포함한다. 특히,이 절제 기술은 쉽게 재생 메커니즘과 진화, 눈 줄기 세포와 그 유지 보수 및 phototaxic 행동 반응과 신경 학적 기초의 더 나은 이해를위한 약물 및 유전자 (RNA 간섭) 화면과 결합 될 수있다.
Introduction
플라나리아는 성체 줄기 세포 매개 재생 연구를위한 강력한 모델 생물이다. 이 비 기생 담수 편형 동물은 중추 신경계와 뇌의 1을 포함한 모든없는 조직을 재생하는 능력을 가지고있다. (계내 혼성화, 면역 조직 화학, RNA 간섭 (RNAi의) 및 transcriptomics, 이러한 시퀀스 게놈 등)까지 거슬러 과거 10-15 년간 플라나리아 필드 1700 2, 기술적 진보로서 전공이 과거 모델 생물을 업데이트 한 . 특히, 플라나리아는 최근 눈 연구 3에 대한 새로운 모델로 인기를 얻고있다.
플라나리아는 두 조직 유형, 광 수용체 신경 세포와 색소 세포의 전형 눈을 가지고; 이는 눈 줄기 세포 인구의 특성을 활성화하고 동일한 유전자의 많은 척추 동물의 눈 드를 조절 것을 보여 주었다velopment은 플라나리아 4, 5에 보존되어있다. 시신경 컵 등쪽에 위치하고 있으며 광 수용체 뉴런의 흰색, 착색 수상 돌기 및 반 달 검은 색소 세포 구성하고, 눈은 광학 chiasm 통해 뇌에 분포되어있다. 재생 공정 6을 해명하기위한 모델 것에 더하여, 플라나리아 눈 시각기구 (7)의 진화 연구에 적합하고, 행동 반응은 광 (8)과 동작 (9)의 신경 기초 (플라나리아 마이너스 phototaxis 표시).
플라나리아 안구 재생성은 크게 두 가지 상황에서 연구되었다 : 재생 헤드의 일부가 잘린 (4), (10) 아래, 바로 눈 조직의 적출 (11)는 다음과 같이 12 </> SUP. 이 단순하고 간단 그대로 눈의 재생에 대부분의 플라나리아 연구는 잘린 방법을 사용했다. 일부 연구는 단지 눈 (잘린 부분) (15) 뒤에 절단을 수행하고 있지만 현재까지 가장 흔한 플라나리아 눈 절단 방법은, 미세 유리 모세관 튜브 (13), (14)와 펀치 구멍을 통해왔다. 그러나, 이러한 방법의 모든 잠재적 결과의 해석을 복잡하게, (뇌, 내장, 그리고 nephridia 등) 만 눈이 아닌 다른 많은 조직의 손실을 포함한다. 여기에 제시된 눈 박리 프로토콜 눈에 더 구체적인 데이터의 결과 (특히 뇌 제외) 안구 조직에 절제를 제한한다. 또한, 공급 시작 7-14 일이 소요될 참수 웜 달리 눈 절제 웜 performe 될 (RNAi의 음식을 통해 제공되는)의 RNAi 실험을 가능하게 박리 (12)의 24 시간 이내에 사료 것d를 동시에.
눈 절제가 성공적으로 잘린 것보다 수행 할 기술적으로 어렵게하지만, 눈 절제술을 포함하는 현재의 연구는 그 절차에 대한 자세한 지침을 포함하지 않았습니다. 이 비디오 문서의 목적은 지속적으로 기본 뇌 조직을 방해하고 가능한 한 적은 수의 다른 조직을 제거하지 않고 플라나리아 광학 컵을 제거하기 위해 연구자 수 있도록하는 것입니다. 이 방법은 단일 및 이중 눈 제거에 사용 및 조사의 넓은 범위에 적용 할 수 있습니다. 가장 재생 분석처럼 눈 박리 잘 약리 유전 (RNAi의) 스크린뿐만 아니라 행동 연구 모두의 조합에 적합하다. 여기에서는, 웜의 취급 방법을 기술 플라나리아 콜로니를 유지하고, 눈 박리 법 자체.
Protocol
Representative Results
Discussion
이것은 눈 박리 방법은 뇌 조직을 제외하고, 안구 조직에 주로 절단을 제한함으로써 (예컨대 펀치 구멍 등) 현재의 방법을 개선한다. 기술자 경험이 있지만 양심적 학부 학생들에게 microsurgeries 경험에서 연습으로,이 기술은, 대부분의 개인에 의해 수행 될 수있다. 이 기법은 이전에 면역하거나 눈 마커 (들) (4, 5), (13) 계내</em…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기능 분석에 대한 지원이 눈 절제 기술, 테일러 Birkholz 완성을 위해 미셸 Deochand 감사의 말씀을, 펠티어 플레이트에 대한 자세한 내용은 안티 아레스 항체 마이클 레빈, 그리고 준지 Morokuma. 이 작품은 WSB에 웨스턴 미시간 대학에서 SFSA 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands | SS15-10 | "10 Gallon" box (net weight 3 lbs) |
| Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe | Kimberly-Clark | 34155 | 4.5 x 8.5 in |
| Whatman #2 filter paper | Sigma | WHA1002125 | Circles, 125 mm diameter, white |
| Easy Touch Insulin syringe (with needle) | Pet Health Market | 17175-04 | U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle |
| 100 mm Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 x 15 mm |
| 60 mm Petri dish | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Inox, straight tip , 11 cm |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile |
| Parafilm M paraffin film | Brand | 701606 | 4 in x 125 ft roll |
| 12-well untreated tissue culture plate | VWR | 15705-059 | Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand |
| Plastic food containers (for colony) | Ziploc | Large rectangle | 2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16" |
| Planaria (Girardia tigrina) | Carolina Biological | 132954 | Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work. |
| Planaria (Schmidtea mediterranea) | n/a | n/a | S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals. |
| Brown paper towels | Grainger | 2U229 | 9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED |
| Wash bottle (for worm water), optional | VWR | 16650-275 | Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL |
| Anti-synapsin antibody, optional | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3C11 | Supernatant |
| Anti-arrestin antibody, optional | n/a | n/a | Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University |
| Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional | Nalge Nunc International Corporation | 2324-0015 | 15 L, polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers |
| Custom Peltier plate, optional | Williams Machine, Foxboro, MA | n/a | Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University: Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2). The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate. |
| DC power source (for Peltier plate), optional | B & K Precision | 1665 | Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps. |
| Other common supplies | |||
| Gloves | |||
| Razor blade | |||
| Scissors | |||
| Dissecting scope with gooseneck lighting | |||
| Chopstick rests, optional |
Riferimenti
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